小麦MLO基因家族全基因组鉴定揭示其介导白粉病抗性与非生物胁迫应答的双重功能

本研究针对小麦白粉病抗性基因资源匮乏的问题，通过全基因组鉴定技术系统解析了小麦MLO基因家族的特征。研究人员鉴定出47个TaMLO基因，发现其中10个基因在生长发育与胁迫应答中具有重叠表达模式，并通过qRT-PCR验证了这些基因在白粉病菌侵染下的差异表达。该研究为利用MLO基因培育广谱抗病且气候适应性强的小麦品种提供了重要遗传资源。

　　

随着气候变化的加剧，植物病害的发生频率和严重程度正在全球范围内产生深刻影响。小麦作为世界上最重要的粮食作物之一，正遭受白粉病（Powdery Mildew, PM）的严重威胁。这种由布氏白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tritici, Bgt）引起的病害，可导致高达62%的产量损失，每年造成约5-10%的减产。培育抗病品种是防治白粉病最可持续的策略，然而尽管已有100多个抗白粉病基因/等位基因被报道，但克隆的抗病基因数量仍然有限，且小麦育种项目中缺乏“易于使用”的抗病基因。

在这样的背景下，Mildew Locus O（MLO）基因家族引起了研究人员的极大兴趣。该基因家族是植物特有的基因家族，在疾病抗性中发挥负调控作用。MLO基因编码具有七个跨膜结构域的保守蛋白，含有钙调蛋白结合结构域，可能作为膜结合受体发挥作用。在大麦中，MLO基因的功能缺失突变赋予了对白粉病的广谱抗性，这种抗性持续时间超过30年。在小麦中，同时敲除TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1基因（在本研究中重命名为TaMLO3/6-A2、TaMLO3/6-B2和TaMLO3/6-D2）可赋予可遗传的广谱白粉病抗性。

尽管MLO基因的重要性已被认识，但迄今为止，关于小麦MLO基因（TaMLOs）的全基因组鉴定信息仍然缺乏，这阻碍了其详细功能表征和在小麦育种项目中的进一步利用。面包小麦高质量参考基因组数据的出现，为全面鉴定和表征这一重要基因家族提供了坚实基础。

研究人员利用国际小麦基因组测序联盟（IWGSC）提供的最新面包小麦基因组注释数据（RefSeq v2.1），通过全基因组搜索方法全面鉴定和表征了47个MLO基因。研究采用了生物信息学分析、系统进化分析、基因结构和基序分析、基因复制和进化分析、microRNA靶向分析、计算机表达分析和定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）验证等技术方法。实验材料包括抗白粉病小麦品系N9134和感病栽培种Fielder，接种白粉病菌后在不同时间点采集叶片样本进行表达分析。

全基因组鉴定和TaMLOs的特性

研究人员通过严格的BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）搜索，最初鉴定出61个候选TaMLOs，在去除冗余基因和含有不完整MLO结构域的基因（假基因）后，共47个非冗余TaMLOs被保留用于详细的下游分析。这些基因被重新命名，遵循小麦基因命名的最新指南。47个TaMLOs的数量在开花植物中位居第二，仅次于八倍体草莓的68个MLOs，这与面包小麦的六倍体性质相符。

TaMLO蛋白的等电点在6.30到9.71之间变化，分子量在46.98到68.50 kDa之间。肽段长度从409到612个氨基酸不等，平均长度为514个氨基酸。大多数TaMLOs在A、B和D亚基因组中有三个同源基因，具有相当数量的氨基酸和分子量。TaMLO蛋白的亚细胞定位预测为质膜，这与之前在不同植物物种中的报道一致。

TaMLOs在小麦基因组中的分布

所有47个TaMLOs被鉴定并在全基因组水平上分配到21条染色体。这些基因随机分布在染色体上，A（约34%）、B（约30%）和D（约36%）亚基因组的贡献几乎相等。4条染色体（2A、2B、2D和5A）各含有最多4个TaMLOs，而3条染色体（4B、4D和7D）各含有3个基因。6条染色体（1A、1B、1D、6A、6B和6D）各含有2个基因。研究还观察到携带TaMLOs的不平衡同源基因。

TaMLOs的系统进化分析

构建最大似然树以确定TaMLO蛋白之间的进化关系，将这些蛋白分为四个不同的进化枝。进化枝II是最大的进化枝，有28个成员（占TaMLOs的59.57%），而进化枝I、III和IV分别包含6个、6个和7个成员。进化枝I包含TaMLO4-A1、TaMLO4-B1、TaMLO4-D1、TaMLO11-A1、TaMLO11-B1和TaMLO11-D1。进化枝III包含TaMLO1-A1、TaMLO1-B1、TaMLO1-D1、TaMLO12-A1、TaMLO12-B1和TaMLO12-D1，而进化枝IV包含TaMLO3/6-A1、TaMLO3/6-A2、TaMLO3/6-A3、TaMLO3/6-B1、TaMLO3/6-B2、TaMLO3/6-D1和TaMLO3/6-D2。此外，进化枝II中的28个TaMLOs被进一步分为三个亚进化枝，即IIA、IIB和IIC。

MLOs在不同进化枝中的分布被认为与它们的感病性或抗性有关。在单子叶植物中，进化枝IV被报道含有与白粉病感性相关的MLOs。例如，大麦中的HvMLO和小麦中的TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1（在本研究中重命名为TaMLO3/6-A2、TaMLO3/6-B2和TaMLO3/6-D2）属于进化枝IV。

基因结构和保守基序分析

基因结构分析显示，TaMLOs有9到15个外显子。总共21个MLOs（45%）含有13个外显子，而12个基因有14个外显子。同样，5个基因各含有15和11个外显子。进化枝I、III和IV的所有成员具有相似的内含子/外显子分布，而进化枝II成员表现出三种不同的内含子/外显子模式，这与它们被分类为亚进化枝一致。

在47个TaMLO蛋白中鉴定出16个保守基序，宽度范围从11（基序12）到50（基序5）个氨基酸。不同系统进化枝中的基序的性质、数量和模式既表现出保守性，也表现出多样性。八个基序在几乎所有TaMLO蛋白中都是保守的。这些八个保守基序突出了TaMLOs之间基本结构和功能的相似性。几乎所有98%的TaMLOs都被发现具有七跨膜结构，这是不同植物物种的保守特征。

拟南芥、水稻和小麦MLOs的比较系统进化分析

为了推断进化关系和对TaMLOs进行重新命名，使用来自这三个物种的MLO蛋白构建了比较系统进化树。所有蛋白被分为四个进化枝，进化枝编号采用拟南芥的分类方式。进化枝I、II、III和IV分别包含6个、28个、6个和7个TaMLO蛋白，与仅小麦蛋白的系统进化分析一致。MLOs在不同进化枝中的分布可能与它们的功能有关。

TaMLOs的基因复制和进化分析

基因复制对于植物基因家族的扩展和进化至关重要。共鉴定出50个重复基因对，对应42个TaMLOs。94%的复制是片段复制，即重复基因出现在不同的染色体上。而只有6%的基因对是串联重复。

通过计算所有重复基因对的同义（Ks）和非同义（Ka）替换率，进行了进化分析。结果显示，TaMLOs重复对彼此之间的分化时间在360万年至1983万年之间。Ka/Ks比值范围在0.052到0.373之间，表明强烈的纯化选择作用于重复基因的密码子，以保守它们的白粉病响应功能。

靶向TaMLOs的MicroRNAs

通过psRNATarget服务器共鉴定出121个miRNAs，靶向41个TaMLOs，包括八个miRNAs靶向TaMLO3/6-B2。同样，七个miRNAs分别靶向TaMLO3/6-A1和TaMLO4-D1，而六个miRNAs靶向TaMLO1-B1。六个miRNAs包括tae-miR5384-3p、tae-miR9679-5p、tae-miR9657a-3p、tae-miR9781、tae-miR167c-5p和tae-miR167a是最普遍的靶向TaMLOs的miRNAs。

TaMLOs的计算机表达分析

在不同生长发育阶段的表达：分析了TaMLOs在多个组织不同时间点的表达，以深入了解它们的功能作用。总共28个MLOs（约60%）在整个生长发育期间至少在两个不同组织中表达。其中，至少9个基因（TaMLO9-A1、TaMLO10-A1、TaMLO3/6-A2、TaMLO8-A1、TaMLO3/6-B2、TaMLO8-B1、TaMLO3/6-D2、TaMLO8-D1和TaMLO10-D4）在几乎所有研究的组织中显示泛表达。

在不同非生物和生物胁迫下的表达：研究了在四种非生物和三种生物胁迫下小麦MLOs的转录变化。非生物胁迫包括冷、旱、热和磷酸盐饥饿，而生物胁迫包括赤霉病（Fusarium Head Blight, FHB）、白粉病（PM）和条锈病（Stripe Rust, SR）。几乎65%的基因在至少一种非生物和/或生物胁迫应用后表达。

TaMLOs的定量RT-PCR分析

由于计算机分析显示10个基因在生长发育以及非生物和生物胁迫下具有高度重叠的表达，因此选择这些基因在四个不同时间点接种白粉病菌后进行qRT-PCR验证。总的来说，这些基因的表达在接种后24小时（hpi）开始升高，并在72 hpi达到峰值失调。值得注意的是，这10个基因中有7个属于进化枝II，而3个基因属于进化枝IV，并且所有基因在不同亚进化枝之间具有同源关系。

研究结果表明，TaMLO8、TaMLO10和TaMLO3/6的同源基因在Bgt抗性小麦品系（N9134）中与感病栽培种（Fielder）相比表现出显著上调。然而，TaMLO9-A1显示上调，而TaMLO9-D1在Bgt抗性品系中显示下调。四个基因（TaMLO8-A1、TaMLO8-D1、TaMLO10-A1和TaMLO10-D1）在接种Bgt后24、48和72小时在抗性品系中表现出显著上调。同样，五个基因（TaMLO9-A1、TaMLO3/6-A2、TaMLO3/6-B2、TaMLO8-B1、TaMLO3/6-D2和TaMLO8-D1）在接种后2-3天在抗性品系中表现出显著更高的表达，表明白粉病抗性的正调控。而单个基因（TaMLO9-D1）在抗性小麦品系中显示下调，表明白粉病抗性的负调控。

本研究通过全基因组鉴定技术系统解析了小麦MLO基因家族的特征，发现47个TaMLO基因随机分布在21条小麦染色体上，具有七个跨膜结构域，主要定位于质膜。比较系统进化分析将小麦MLOs分为四个进化枝（I-IV），分别包含6、28、6和7个基因。进化分枝得到基因结构和基序分布的强烈支持。进化分析显示，MLO基因库通过片段复制扩展，纯化选择可能保守了它们的胁迫相关功能。计算机表达分析突出了至少10个基因在不同生长发育阶段以及非生物和生物胁迫条件下具有重叠表达模式。定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）验证了这10个重叠基因在白粉病抗性和感病小麦基因型中接种白粉病菌病原菌株后不同时间间隔的差异表达模式。

鉴定出的小麦MLO基因，特别是10个重叠基因，突出了未开发的遗传多样性，可用于设计对非生物和生物胁迫（尤其是白粉病抗性）的持久和广谱耐受性/抗性。总的来说，这项研究提供了小麦MLO基因的概要，这些基因可以通过功能表征来确认它们在白粉病抗性中的作用，并进一步在小麦育种项目中开发利用，以开发气候适应型栽培种，实现可持续小麦生产。

这项研究的重要意义在于为小麦白粉病防治提供了新的基因资源，同时揭示了MLO基因在非生物胁迫应答中的潜在功能，为培育具有广谱抗病性和气候适应性的小麦品种奠定了理论基础。通过基因编辑技术如CRISPR/Cas9靶向这些基因，有望实现白粉病抗性的精准改良，同时避免不良副作用的出现。此外，该研究建立的基因家族分析方法和获得的全基因组资源也为其他作物基因家族研究提供了重要参考。