眼见为实，精准选育：RUBY标记助力CRISPR无转基因水稻育种新突破

本研究针对CRISPR植物基因组编辑中转基因成分高效剔除的难题，开发了一种整合可视化RUBY标记的模块化CRISPR-Cas9工具包。通过水稻OsCCD8和OsLAZY基因的编辑实验，实现了100%的编辑效率，并利用胚乳特异性表达的OsGluC启动子驱动RUBY标记，在T1代糙米中直观区分转基因与非转基因种子，显著提高了无转基因株系的筛选效率。该研究为多物种CRISPR编辑系统提供了可推广的技术框架。

　　

在植物功能基因组学研究领域，CRISPR-Cas9基因组编辑技术已成为创制基因敲除突变体的关键技术手段。然而，如何高效获得遗传稳定的无转基因编辑植株仍是当前面临的重要挑战。传统的通过孟德尔遗传分离去除外源CRISPR构建体的策略需要进行繁琐的PCR分子筛查，而现有的可视化标记（如花青素报告基因或荧光蛋白）又存在应用范围有限的问题。虽然转基因清除CRISPR（Transgene Killer CRISPR, TKC）系统通过花粉特异性表达细胞毒素（如CMS2和BARNASE）实现了载体自切除，但其物种特异性限制了更广泛的应用。

近年来，嵌合RUBY标记的出现为这一难题提供了新的解决方案。该标记能够通过内源酪氨酸合成可见的红色甜菜碱色素，已在水稻、拟南芥、烟草等多种植物中被用于基因表达和转化过程的监测。然而，真正模块化的载体架构设计仍然缺乏，这限制了CRISPR系统在不同物种中的高效应用。

针对这些技术瓶颈，Liu等研究人员在《Rice》发表了题为“Seeing Red, Selecting True: RUBY-Reported Seed Marker Streamlines CRISPR-Clean Rice Breeding”的研究论文。该研究开发了一种整合RUBY标记的模块化CRISPR-Cas9工具包（RUBY-assisted Modular CRISPR-Cas9 toolkit, RMC），为解决无转基因植株筛选和载体模块化问题提供了创新性方案。

研究人员采用的主要技术方法包括：模块化载体设计（包含植物抗性标记、CRISPR转录单元和转基因清除模块）、水稻品种中花11（Zhonghua 11）的农杆菌介导稳定转化、限制性内切酶酶切检测突变效率、Sanger测序验证突变类型，以及利用OsGluC启动子驱动RUBY标记实现胚乳特异性表达可视化筛选。

研究结果

载体设计与构建

研究人员首先构建了模块化的CRISPR-Cas9基因编辑载体PMC-OsR41。该载体包含三个 distinct 模块：植物抗性标记模块、由玉米Ubiquitin启动子驱动的CRISPR转录单元（包含Cas9和自切割tRNA^Gly辅助的gRNA cassette），以及由OsGluC启动子驱动RUBY的转基因清除模块。载体设计采用GoldenGate克隆策略，允许通过单一BsaI酶切位点快速上传靶点序列。

编辑效率分析

选择OsCCD8（Oryza sativa CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 8）的两个靶点和OsLAZY的一个靶点进行效率验证。通过稳定转化获得51株转基因阳性T0植株，限制性酶切分析显示所有植株在目标位点都产生了突变，测序结果进一步证实了100%的编辑效率，突变类型包括纯合和双等位基因突变。

表型分析

OsCCD8敲除突变体表现出矮化和分蘖数增加的表型，而OsLAZY敲除突变体则呈现分蘖展开的表型。这些表型与先前报道的功能缺失突变体一致，验证了CRISPR编辑的有效性。值得注意的是，大多数OsCCD8编辑株系未能抽穗结实，只有携带弱移码突变的株系能够产生种子，表明突变类型严重程度影响育性。

无转基因株系筛选

在T1代种子中，通过糙米颜色可视化区分转基因与非转基因种子。红色种子表示含有RUBY标记的转基因个体，正常颜色种子则为无转基因个体。从16个独立株系中筛选出的170粒正常颜色种子经PCR验证全部为无转基因植株，证明该系统的有效性和可靠性。

讨论与结论

该研究开发的RMC工具包成功解决了CRISPR植物基因组编辑中的两个关键问题：通过组件模块化简化了载体优化过程，通过可视化标记实现了无转基因后代的快速筛选。系统在水稻中的高效验证表明，OsGluC启动子驱动的RUBY标记能够在胚乳中特异性表达，不影响种子发育，且红色表型易于肉眼识别。

研究的创新性在于：第一，实现了CRISPR编辑与可视化标记的有机整合，避免了繁琐的分子检测；第二，模块化设计使其具备多物种适应性，只需更换相应的启动子和优化元件即可应用于其他植物；第三，编辑效率达到100%，且突变能够稳定遗传。

值得注意的是，该研究还揭示了突变类型对表型的影响。在OsCCD8编辑中，只有携带弱突变的株系能够保持育性，这提示在基因功能研究中需要充分考虑到突变严重程度对表型的影响，也为未来研究提供了重要参考。

该技术的推广应用将显著加速作物育种进程，特别是在需要多次编辑和多基因聚合的复杂育种项目中。通过简化无转基因株系的筛选流程，降低技术门槛和操作成本，使得CRISPR技术能够更广泛应用于功能基因组研究和作物遗传改良。

未来研究方向包括：将该系统拓展到其他重要作物，测试不同物种特异性启动子的效率，以及开发更高效的多基因编辑策略。同时，进一步优化RUBY表达水平，确保在不同遗传背景下都能实现稳定可靠的颜色标记。

总之，这项研究为植物基因组编辑提供了一个高效、可视化的技术平台，不仅推动了基础研究的发展，也为作物遗传改良提供了强有力的技术支撑。