苹果MdAGG凝集素通过CRISPR/Cas9和内含基因策略增强火疫病抗性的机制研究

本研究针对苹果火疫病抗性机制展开创新性探索，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术验证了MdAGG凝集素家族在化学诱导抗性中的关键作用，并首次利用病原诱导型启动子pPPO16驱动MdAGG10表达，成功创制出具有显著火疫病抗性的苹果新种质。该研究为果树抗病育种提供了新型内含基因策略，突破了传统抗性基因应用的局限性，对推动绿色植保具有重要意义。

　　

火疫病作为由解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylylovora, Ea)引起的毁灭性病害，长期制约着全球苹果产业发展。该病原菌通过Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system, T3SS)效应蛋白和胞外多糖(EPS)等毒力因子侵染宿主，传统防治手段效果有限且抗病育种进展缓慢。目前鉴定的抗性数量性状位点(QTL)主要来源于野生苹果资源，但病原菌已进化出可规避这些抗性基因的新机制，使得培育持久抗性品种成为产业迫切需求。

在这项发表于《Horticulture Research》的研究中，法国昂热大学的研究团队另辟蹊径，将目光投向植物免疫系统中的下游防御基因——苋菜凝集素类似蛋白(MdAGG)。该蛋白家族在化学激发子苯并噻二唑-7-甲硫酯(ASM)处理后显著上调，能够通过凝集作用阻碍细菌扩散，但其在植物体内的具体功能尚未得到遗传学验证。

研究人员采用多组学技术结合分子生物学方法，首先通过CRISPR/Cas9系统对'Gala'苹果品种的MdAGG基因家族进行多位点编辑。设计双重引导RNA(gRNA1和gRNA2)靶向18个MdAGG成员，通过农杆菌介导的遗传转化获得5个编辑株系。通过对编辑位点的高通量测序分析，发现编辑类型包括点突变(A型)、大片段缺失(B型)和基因间缺失(C型)等多种变异。离体枝条接种实验表明，除mdagg-4外，其他编辑株系在ASM处理后仍保持感病性，证明MdAGG功能缺失会削弱诱导抗性。

在功能获得性研究中，团队创新性地将Ea诱导型多酚氧化酶基因启动子(pPPO16)与MdAGG10编码序列融合，构建内含基因载体。转化获得的9个株系在病原侵染早期即表现出MdAGG10的特异性高表达。表型分析显示，pPPO16::MdAGG10转基因株系在离体和温室条件下均显著增强了对火疫病的抗性，且ASM处理可进一步强化该抗性——病害严重度降低约90%，而组成型过表达该基因会导致植株发育缺陷。

关键技术方法包括：基于GDDH13基因组设计特异性gRNA的CRISPR/Cas9编辑系统；利用pPPO16病原诱导型启动子和MdAGG10编码序列构建的内含基因载体；农杆菌介导的'Gala'苹果遗传转化体系；离体枝条高通量接种筛选平台；编辑效率qPCR定量检测方法；Western blot蛋白水平验证技术。

Generation of transgenic lines

通过农杆菌介导转化获得5个CRISPR编辑株系(mdagg-1至mdagg-5)和9个pPPO16::MdAGG10过表达株系，转化率分别为1.19%和0.78%。

Dual guide-RNA edition of MdAGG genes leads to multiple loss-of-function mutations

测序分析显示编辑类型多样，包括碱基插入缺失(Indel)、大片段删除(最大212 kb)和序列倒位等，均导致提前终止密码子产生。

MdAGG loss-of-function mutants are impaired in their ASM-induced resistance response toward E. amylovora

编辑株系在ASM处理下仍保持感病性，Western blot证实MdAGG蛋白缺失，证明该家族是ASM诱导抗性的必要条件。

Molecular and phenotyping characterization of pPPO16::MdAGG10 inducible lines under E. amylovora inoculation challenge

病原侵染24-40小时后，转基因株系MdAGG10表达量显著上调，且不与组成型表达一样引起生长缺陷。

Greenhouse-grown pPPO16::MdAGG10 apple lines are less susceptible to Erwinia amylovora

温室接种实验证实转基因株系病害发生率显著降低，植株生长正常，结合ASM处理可实现近完全抗性。

研究结论表明，MdAGG凝集素家族是苹果免疫系统中不可或缺的防御组分，其通过识别细菌多糖组分(EPS/LPS)介导凝集作用。该研究首创的"病原诱导型启动子+防御基因"内含基因策略，成功实现了抗性增强与正常生长的平衡，为解决防御基因组成型表达导致的负效应提供了新思路。相比基于R基因的传统抗性机制，靶向病原菌保守多糖特征的MdAGG介导抗性更不易被病原菌规避，具有重要应用潜力。该研究为果树抗病育种提供了新工具，对推动绿色农业发展具有重要意义。