叶酸-多聚精胺纳米颗粒递送双gRNA CRISPR/Cas9系统敲除B2M基因实现MHC I类分子清除的优化策略

本研究开发了基于精胺、聚乙二醇和叶酸的FolicPolySpermine纳米颗粒，可高效递送靶向B2M基因的双gRNA与Cas9系统。该非病毒载体在HEK293T细胞中实现了特异性基因敲除，其转染效率与lipofectamine 2000相当，为器官移植排斥反应提供了新型基因治疗解决方案。

　　

^亮点

^缩写词

AAV（腺相关病毒）|BME（B2m外显子1）|BMI（B2m内含子1）|CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）|DCC（二环己基碳二亚胺）|DLS（动态光散射）|DSB（双链断裂）|FA（叶酸）|FC（流式细胞术）|FACS（荧光激活细胞分选）|GFP（绿色荧光蛋白）|HEK 293（人胚胎肾293细胞）|HDR（同源定向修复）|MHC（主要组织相容性复合体）|NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）|NHEJ（非同源末端连接）|PEG（聚乙二醇）|gRNA（向导RNA）|SPE（精胺）

^{向导RNA设计与CRISPR/Cas9质粒制备}

采用在线CRISPR工具（http://crispr.mit.edu/）设计了两对靶向B2m外显子1（BME）和内含子1（BMI）的向导RNA（表1）。两个gRNA在DNA序列上的间距达2.2 kb。将各gRNA的正义链和反义链寡核苷酸杂交形成双链体，随后将每个双链体导入PX458（addgene #48138）表达质粒的FastDigest BpiI（FD1014, Thermo Scientific）限制位点。该质粒包含U6启动子驱动的gRNA支架和CMV启动子表达的Cas9-GFP融合蛋白。

^结果

通过菌落PCR和直接测序验证了双sgRNA质粒构建过程的可靠性。分光光度法确认了合成质粒的质量和浓度。PCR扩增结合凝胶电泳和桑格测序证实，在B2m基因的两个向导RNA靶点之间成功删除了约2.2 kb的基因组片段。值得注意的是，在缺失区域侧翼观察到插入/缺失突变（indels）的变异现象。

^讨论

基因组编辑为细胞移植的多个领域带来新机遇，包括干细胞治疗（例如校正自体细胞中的突变）和异种移植（例如沉默供体中异种抗原编码基因）。CRISPR/Cas9因其简便性、多功能性和易用性正快速取代先前的编辑平台。Cas9核酸酶的理性设计显著降低了脱靶事件的发生率且未影响效率。临床前研究证实了CRISPR/Cas9在体外和体内编辑中的巨大潜力。

^结论

由精胺、聚乙二醇与叶酸共轭组成的FolicPolySpermine纳米颗粒，在递送CRISPR/Cas9系统关键组分方面的效能与商品化lipofectamine 2000相当。因此，FolicPolySpermine为向人类细胞靶向递送CRISPE/Cas9系统提供了一种经济、安全且便捷的载体。

^结论

（注：此处保留原文两个Conclusion的翻译结构）