自身免疫相关蛋白DIORA1通过结合MRCK激酶家族调控细胞运动性的机制研究

本研究发现自身免疫相关基因DIORA1（又称FAM167A）直接结合丝氨酸/苏氨酸激酶家族MRCK（Myotonic Dystrophy Kinase-Related Cdc42-Binding Kinases），通过调控细胞运动性和上皮-间质转化（EMT）过程，为理解自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎）和癌症转移的分子机制提供了新视角。

　　

Significance

Disordered autoimmunity 1 (DIORA1) 作为一种与多种自身免疫性风湿病遗传相关的蛋白，其细胞功能长期以来未知。本研究首次发现DIORA1是肌强直性营养不良激酶相关Cdc42结合激酶（MRCK kinases）的直接相互作用蛋白，该激酶家族是Rho GTP酶信号通路的关键效应器。DIORA1敲低降低了已知MRCK靶标的磷酸化水平，并诱导了与上皮-间质转化（EMT）相关的转录组和蛋白质组变化，同时增强细胞侵袭能力。这些发现揭示了DIORA1作为特定激酶家族相互作用蛋白和细胞运动性调控因子的新角色，为探索DIORA1在自身免疫致病性和癌症转移等运动性驱动生物过程中的重要性奠定了基础。

Abstract

遗传学研究将DIORA1与多种自身免疫性风湿病相关联，包括系统性红斑狼疮、干燥综合征、类风湿关节炎、多发性肌炎和系统性硬化症。本研究通过相互作用图谱分析，发现DIORA1直接结合MRCK激酶家族的三个不同结构模块：保守的激酶抑制 motif（KIM）、C1-PH和citron同源结构域（CNH）。在人类细胞中敲低DIORA1会改变细胞磷酸化模式，降低已知MRCK靶标的磷酸化水平。RNA测序和蛋白质组学分析显示上皮-间质转化相关基因和蛋白的上调，功能分析证实DIORA1敲低后细胞侵袭能力增强。这些发现确立了自身免疫相关蛋白DIORA1作为MRCK激酶的相互作用蛋白和细胞运动性的调控因子。

Introduction

大多数在全基因组关联研究中与人类疾病相关的基因功能已知，但FAM167A（编码DIORA1蛋白）作为一个功能未表征的基因，其多态性与多种风湿性疾病相关。DIORA1是一个214个氨基酸的进化保守蛋白，缺乏同源性信息指导功能研究。风湿性疾病作为自身反应性免疫应答的结果，免疫细胞活性依赖于细胞骨架动力学和细胞运动性，这些过程由Rho家族GTP酶（如Rac1、Rho、Cdc42）及其下游激酶调控。本研究旨在探究DIORA1的细胞功能，特别是其与MRCK激酶的相互作用及其在细胞运动性调控中的作用。

Results

BioID Proximity Proteomics Identifies DIORA1 as Part of an Actomyosin Regulatory Network

为鉴定DIORA1相互作用的蛋白，研究采用BioID邻近标记蛋白质组学方法。在HEK293T细胞中诱导表达Myc-BioID2-DIORA1，通过生物素标记和链霉亲和素纯化结合质谱分析，鉴定出90个独特的DIORA1相互作用蛋白。其中，MRCK激酶家族成员MRCKA（CDC42BPA）和MRCKB（CDC42BPB）在两个独立实验中均被检测到。通过FLAG标记DIORA1的共免疫沉淀质谱分析（coIP-MS/MS）进一步验证了MRCK激酶与DIORA1的相互作用。STRINGdb相互作用网络分析显示，DIORA1与肌动球蛋白细胞骨架调控网络相关蛋白相连，提示其在细胞骨架调控中的潜在作用。

DIORA1 Binds to the Kinase Inhibitory Motif, C1-PH–, and CNH-Regions of MRCK Kinases

MRCK激酶是多结构域蛋白，在细胞骨架组织和细胞运动性中发挥重要作用。为绘制DIORA1与MRCK激酶的相互作用位点，研究构建了一系列截短的MRCKB构建体。实验表明，DIORA1与MRCKB的中心卷曲螺旋区域（aa 669-1137）相互作用，并进一步定位到激酶抑制 motif（KIM，aa 797-893）。令人惊讶的是，缺失KIM的构建体仍与DIORA1相互作用，提示存在额外的结合位点。研究最终发现DIORA1与MRCKB的C1-PH-CNH模块（aa 1020-1582）强烈相互作用。体外下拉实验使用大肠杆菌表达的MBP融合蛋白证实了DIORA1与MRCKB-KIM和MRCKB-C1-PH-CNH的直接结合。精细映射显示，DIORA1独立结合C1-PH区域（aa 1025-1214）和CNH区域（aa 1219-1560），而相邻的CRIB区域（aa 1561-1711）无相互作用。这些结果表明DIORA1通过三个离散位点与MRCK结合：KIM motif、C1-PH和CNH区域。此外，DIORA1与所有三种MRCK激酶（MRCKA、MRCKB、MRCKG）的KIM区域和C1-PH-CNH模块均发生相互作用，表明其作为pan-MRCK激酶结合器的功能。

AlphaFold-Based In Silico Modeling and Coimmunoprecipitation Reveal the Parts of DIORA1 Interacting with MRCKB

为探究DIORA1中与MRCKB结合的区域，研究采用AlphaFold多重结构预测模型。预测显示DIORA1的C端半部（aa 104-214）可能介导与MRCKB的相互作用。实验验证表明，DIORA1的C端半部（DIORA1-2）与全长MRCKB共免疫沉淀，而N端片段（DIORA1-1）则不能。进一步分析发现，DIORA1-3（aa 104-157）片段与MRCKB-KIM相互作用，而DIORA1-6（aa 158-214）与C1-PH-CNH模块相互作用。点突变实验（R124A、E126A、D134A）破坏了DIORA1与KIM的结合。此外，DIORA1的C端区域（aa 184-214）主要负责与C1-PH结合，而螺旋片段（aa 157-183）与CNH结构域结合。这些数据揭示了DIORA1与MRCKB之间复杂的三部分相互作用模式。

DIORA1 Deficiency Reduces Phosphorylation of MRCK Downstream Targets MYO18A, ADD1, ADD3, and MYPT1

结合MRCK自抑制KIM motif的蛋白可能调节激酶活性。研究在SK-N-SH细胞中采用CRISPRi敲低DIORA1，并通过磷酸化蛋白质组学分析其效应。DIORA1敲低显著降低了已知MRCK靶标MYO18A、ADD1、ADD3和PPP1R12A/MYPT1的磷酸化水平，而对MYL9和MSN的磷酸化无影响。全局磷酸化分析揭示了110个磷酸化蛋白的显著变化，包括多个Rho GTP酶信号网络中的调控因子，如DOCK11（CDC42 GEF）、ARAP1、ARHGDIB、WASF2/WAVE2和ARPC5。这些结果表明DIORA1影响MRCK激酶活性并调节Rho GTP酶信号网络。

DIORA1 Regulates Expression of Genes and Proteins Associated with Epithelial–Mesenchymal Transition

通过RNA测序分析DIORA1敲低细胞的转录组，发现513个差异表达基因（|log2FC| > 1）。基因集富集分析（GSEA）显示，上皮-间质转化（EMT）基因集是最显著上调的模块，而E2F和MYC靶标基因集则下调。在SK-N-AS细胞中重复实验得到一致结果。蛋白质组学分析进一步证实EMT相关蛋白的上调，而MYC靶标蛋白下调。整合转录组和蛋白质组数据的GSEA分析均突出EMT作为最显著富集的 hallmark 通路。这些发现表明DIORA1敲低导致EMT相关基因和蛋白的上调，支持其在细胞运动性调控中的作用。

DIORA1 Regulates Cell Invasive Capacity

鉴于MRCK激酶在细胞侵袭和迁移中的作用，研究通过Matrigel transwell实验评估DIORA1敲低对细胞侵袭能力的影响。结果显示，DIORA1敲低的SK-N-SH和SK-N-AS细胞侵袭能力显著增强，高达四倍。伤口愈合实验显示SK-N-SH细胞迁移加速。使用选择性MRCK抑制剂BDP-9066（0.1 μM）处理可逆转DIORA1敲低引起的侵袭表型，表明该表型依赖于MRCK激酶活性。这些数据证明DIORA1敲低通过MRCK依赖性机制促进细胞侵袭。

Discussion

本研究揭示了自身免疫相关蛋白DIORA1的细胞功能，发现其与MRCK激酶家族存在复杂的三部分相互作用。DIORA1同时结合KIM motif、C1-PH和CNH区域，可能通过改变MRCK激酶的空间构象调节其底物可及性和功能输出。DIORA1敲低导致MRCK靶标磷酸化减少、EMT相关基因和蛋白上调，以及细胞侵袭能力增强。这些发现为理解DIORA1在自身免疫性疾病和癌症中的作用提供了机制基础，提示其作为治疗靶点的潜力。MRCK激酶抑制剂的开发可能为治疗自身免疫性和癌症疾病提供新策略。

Methods

详细实验方法包括分子克隆、细菌蛋白表达与纯化、细胞系培养与转染、邻近标记蛋白质组学、共免疫沉淀、AlphaFold结构预测、RT-qPCR、RNA测序、蛋白质组与磷酸化蛋白质组分析、细胞运动性实验等，具体见补充材料。