恶性疟原虫环孢子蛋白主要、次要及连接区表位在疟疾疫苗设计中的比较研究及其保护机制解析

本研究针对当前RTS,S/AS01和R21/Matrix-M等疟疾疫苗保护力有限的问题，通过烟草花叶病毒（TMV）病毒样颗粒（VLP）平台系统比较了PfCSP蛋白的主要重复（NPNA）、次要重复（NPNV）和连接区（NPDP）表位的免疫保护效果。研究发现主要重复表位疫苗（T20）在体内能诱导等效于RTS,S的肝脏寄生虫负荷降低，且所需抗体浓度更低，为下一代疟疾疫苗的临床转化提供了关键依据。

　　

疟疾至今仍是全球最严重的公共卫生威胁之一，每年导致数十万人死亡，其中绝大多数发生在非洲地区。尽管杀虫剂和抗疟药物的使用取得了一定成效，但蚊虫抗药性的增强和诊断工具灵敏度的下降正逐渐抵消这些进展。疟疾感染始于携带疟原虫的蚊虫叮咬，将其唾液腺中的孢子体注入人体皮肤。这些孢子体表面密集覆盖着环孢子蛋白（Circumsporozoite Protein, CSP），该蛋白是当前唯一被世界卫生组织推荐的两种疟疾疫苗——RTS,S/AS01和R21/Matrix-M的核心抗原成分。这两种疫苗均包含19个NPNA重复序列和C端结构域，可诱导约50–80%的实验性保护，但在高传播地区的实际保护效力仍显不足，且抗体持续时间较短。

目前疟疾疫苗面临的一个关键问题是，其所需的中和抗体浓度远高于其他疫苗（如新冠疫苗仅需3.6μg/mL，而RTS,S需超过100μg/mL）。近年来研究发现，人源单克隆抗体（mAb）可靶向CSP的三种不同表位：主要重复表位（NPNA）、次要重复表位（NPNV）以及连接区表位（NPDP）。其中，靶向次要重复的mAb L9在极低血清浓度（10μg/mL）下就能提供高效保护，因此被认为具有成为下一代疫苗的潜力。然而，不同研究组的结果存在矛盾，亟需在统一实验条件下进行头对头比较。

为此，Walter Reed陆军研究所（WRAIR）与约翰霍普金斯大学（JHU）合作，利用烟草花叶病毒（TMV）病毒样颗粒（VLP）平台展示不同CSP表位，并在两种独立的小鼠攻击模型中系统评估了它们的免疫原性和保护效力。该研究近期发表于《npj Vaccines》，为基于表位设计的下一代疟疾疫苗提供了重要理论和实验依据。

研究人员采用的主要技术方法包括：利用大肠杆菌表达系统制备TMV VLP抗原；通过尺寸排阻色谱（SEC-HPLC）和负染电镜评估颗粒纯度和形态；使用ELISA和竞争结合抗体定量（CBASQE） assay分析血清抗体反应；通过体外肝脏阶段发育抑制试验（ILSDA）和免疫荧光（IFA）评估抗体功能；最后利用转基因疟原虫静脉攻击模型（WRAIR）和定量肝脏负荷测定模型（JHU）进行体内保护效力评价。

研究结果如下：

Design and purification of novel minor repeat VLPs

研究团队设计了四种靶向次要重复表位的VLP（T89、T90、T91、T93），并在TMV平台上展示。生化分析显示所有VLP纯度高、形态均一。然而抗原性分析表明，最短的T89抗原性最弱，而其他候选疫苗均能被保护性单抗（如317、CIS43、L9）有效识别。

Minor repeat vs. major repeat constructs

在第一次小鼠攻击实验中，使用2.5μg剂量免疫，主要重复疫苗T5和T20分别诱导了60%和40%的无菌保护，而所有次要重复疫苗均未表现出显著保护效力，尽管其抗体在体外能高效抑制肝细胞侵袭。

Minor repeat vs. major repeat vs. junctional+minor repeat constructs

在提高剂量至5μg后，连接区+次要重复疫苗T51显示出30%的保护率，但仍低于T5和T20（40%）。值得注意的是，高抗体滴度并非保护的绝对必要条件，说明抗体质量（如亲和力和表位特异性）可能比数量更重要。

In vitro neutralization by immune sera

体外实验显示，所有疫苗血清在低稀释度下均能抑制超过80%的肝期发育。但在高稀释度（1:150）下，次要重复和连接区疫苗（T90、T91、T51）仍保持较高抑制率，而主要重复疫苗抑制率显著下降。这一发现揭示了体内外保护效果的不一致性。

Major repeat vs. junctional+minor repeat vs. RTS,S

在JHU定量肝脏负荷模型中，T5、T20和T51在ALFQ佐剂配伍下均能诱导超过90%的寄生虫负荷抑制，效果与RTS,S/AS01相当。特别值得注意的是，T20在较低抗体浓度下就达到了与RTS,S相同的保护水平，显示出更优的抗体质量。

Serological mapping of antibody responses

血清表位图谱分析揭示了两类抗体反应模式：一是以次要重复为重点（L9竞争占优），见于T89、T90、T91和T51；另一类以主要重复为重点（317与L9竞争相当），见于T5、T20和RTS,S。后者与更高的保护效力相关。

研究结论与讨论指出，虽然靶向次要重复表位的疫苗在体外表现出优异的中和活性，但其在静脉攻击模型中未能引发显著的无菌保护。这种差异可能与攻击途径有关——静脉攻击更依赖针对高丰度主要重复表位的抗体反应，而蚊叮攻击则可能让针对次要表位的抗体在皮肤局部发挥更强细胞毒性作用。此外，小鼠缺乏人源VH3-33/VK1-5基因，限制了其模拟人体B细胞应答的能力。

唯一非主要重复表位疫苗中显示保护效果的是T51，其设计包含了连接区NPDP和NPNA motif，可能更准确地模拟了天然CSP的空间构象。最终，研究人员选择T20而非免疫原性更强的T5进行cGMP生产，因其在较低抗体浓度下实现同等保护，且抗体具有更理想的317:L9竞争谱和潜在耐久性优势。

该研究不仅澄清了不同CSP表位在疫苗设计中的贡献，还建立了一套结合体内外评价的综合筛选流程，为下一代疟疾疫苗的临床开发提供了关键数据。采用大肠杆菌表达的TMV VLP平台兼具低成本和高效力优势，未来或可进一步用于多阶段、多虫种联合疫苗的研发。