嗜热菌Thermosporothrix hazakensis来源自给自足细胞色素P450酶的表征及其向过氧化物酶的转化

本刊推荐：本研究首次鉴定并表征了来自中度嗜热菌Thermosporothrix hazakensis的CYP102家族细胞色素P450酶（CYP），通过引入E278Q/T279E双突变成功构建了新型过氧化物酶变体HazakQE。该工程化酶能以H2O2为氧化剂高效催化脂肪酸（ω-1至ω-3位羟基化）和芳香化合物（苯乙烯环氧化、四氢萘酮苄位羟基化）的选择性氧化，其热稳定性显著优于中温菌来源的CYP199A4酶，为代谢物鉴定和生物催化氧化反应提供了新平台。

　　

引言

酶作为重要的生物催化剂（biocatalysts）在化学应用中备受关注。理想的工业用生物催化剂应能在环境温度下长期保持活性，甚至耐受高温而不失活。细胞色素P450酶（CYPs或P450s）因其能催化惰性C-H键的区域和立体选择性羟基化反应而成为有价值的生物催化剂。然而目前研究的CYP酶（如P450_cam、P450_BM3或CYP199A4）多来自中温生物，仅能耐受中等温度（约50°C即变性）。寻找热稳定的自给自足型CYP酶成为研究热点，这类酶无需额外电子传递蛋白，具有显著应用优势。

材料与方法

研究团队从嗜热菌Thermosporothrix hazakensis中鉴定出CYP102家族酶，该菌最适生长温度为50°C。通过大肠杆菌表达系统生产该酶，采用固定化金属亲和层析（IMAC）纯化。对野生型全酶和工程化血红素结构域变体（HazakQE，引入E278Q/T279E突变）进行表征，使用紫外-可见吸收光谱、气相色谱-质谱联用（GC-MS）等技术分析酶学性质和催化活性。

结果与讨论

野生型全酶的表征显示，该酶与P450_BM3具有51%序列同一性，其紫外-可见吸收光谱显示分裂的Soret带（394 nm高压态，416 nm低压态）。脂肪酸结合实验表明十六烷酸（棕榈酸）和十七烷酸能诱导最大程度向高压态转变（约85%），说明这些是酶的潜在生理底物。尽管全酶在体外NADPH依赖的氧化反应中活性较低，但在全细胞反应中能有效羟基化十二烷酸、十四烷酸等脂肪酸，主要生成ω-1、ω-2和ω-3位羟基化产物，产物分布与P450_BM3相似。

工程化过氧化物酶变体HazakQE的活性显著提升。该变体在30°C下能高效催化多种底物的H₂O₂依赖型氧化反应：

1. 1.
   脂肪酸氧化：对直链脂肪酸（十四烷酸、十六烷酸、十七烷酸）主要生成ω-1、ω-2和ω-3位羟基化产物；对支链脂肪酸（14-甲基十六烷酸、15-甲基十六烷酸）也显示特异性羟基化模式
2. 2.
   芳香化合物氧化：
   • •
     1-甲氧基萘氧化生成二聚体Russig's蓝染料，可用于酶活性的比色法检测
   • •
     α-四氢萘酮羟基化生成4-羟基-1-四氢萘酮，对映体过量（ee）达60%
   • •
     苯乙烯环氧化反应活性高于P450_BM3 T268E变体（160 vs 120转化数）

热稳定性实验表明，HazakQE在50°C加热30分钟后仍保持94%活性，显著优于中温菌来源的CYP199A4酶（完全失活），但与P450_BM3血红素结构域的热稳定性相当。高温（50°C）下的催化效率降低主要归因于H₂O₂导致的血红素降解加速。

AlphaFold 3预测模型显示，底物脂肪酸在酶活性中心中的结合位置与P450_BM3相似，距离血红素铁较远（>7 ?），说明催化时需要发生底物重定位。

结论

本研究成功表征了来自嗜热菌T. hazakensis的CYP102家族自给自足酶，并通过蛋白质工程将其转化为高效的过氧化物酶变体HazakQE。该酶在30°C下能高效催化多种底物的H₂O₂依赖型氧化反应，虽然其热稳定性未显著优于P450_BM3，但催化效率优于单突变P450_BM3变体。Russig's蓝生成反应为后续酶定向进化提供了便捷的筛选方法。该研究为开发新型生物催化剂和代谢物鉴定平台提供了重要基础。