从基因组到田间：耐盐芽孢杆菌BJ-3作为葡萄灰霉病的新生物防治方案

《Current Research in Microbial Sciences》：From Genome to Field: Bacillus halotolerans BJ-3 as a Novel Biocontrol Solution for Grapevine Botryosphaeria Dieback

葡萄藤干枯病（GTD）由多种真菌引起，其中Lasiodiplodia theobromae危害最甚。本研究分离并鉴定出Bacillus halotolerans BJ-3菌株，通过基因组测序分析发现其携带11个次级代谢产物合成基因簇（包括bacillibactin、fengycin等），体外抑菌试验显示对19种植物病原真菌抑制率55.56%-91.62%，其中对L. theobromae抑制率达69.89%。田间试验表明，稀释500倍的BJ-3水分散粒剂对Botryosphaeria dieback抑制率71.94%，显著优于阳性对照。基因组学分析结合多组学验证，证实BJ-3通过产抗菌肽和铁载体等次级代谢产物抑制真菌，且抑菌效果与浓度正相关，为开发新型生物农药提供了理论依据。

　　近年来，随着全球葡萄种植业的快速发展，葡萄枝干病害（GTD）已成为威胁葡萄产量和品质的重要问题之一。其中，Botryosphaeria dieback（Botryosphaeria枯萎病）因其高致病性和广泛传播性，尤其在温暖的葡萄种植区域，对葡萄种植业构成了严重挑战。当前，传统的化学杀菌剂虽然在一定程度上能够控制这些病害，但其应用带来了诸多健康和环境方面的担忧，因此，寻找更安全、有效的生物防治方法显得尤为迫切。本研究旨在开发一种基于本地分离的BJ-3菌株的生物防治方案，评估其对多种病原菌的抑制能力，并验证其在葡萄枝干病害中的实际防治效果。

葡萄枝干病害通常由多种真菌引起，其中包括Botryosphaeria、Diplodia、Dothiorella、Lasiodiplodia、Neofusicoccum、Neoscytalidium、Phaeobotryosphaeria和Spencermartinsia等属的真菌。其中，Lasiodiplodia theobromae（L. theobromae）被认为是该类病害中最为致命的病原体之一，尤其在温暖地区。该病原菌不仅能感染葡萄，还广泛侵染其他经济作物，如芒果、番木瓜和香蕉等，导致严重的经济损失。此外，L. theobromae还被发现可能引发人类的偶然感染，进一步凸显了其危害性。

针对这一问题，研究团队从北京海淀区的一片葡萄园中分离出一种具有显著拮抗活性的细菌株BJ-3，并对其进行了详细的鉴定和分析。通过形态学观察和系统基因组学分析，确认BJ-3属于Bacillus halotolerans这一种群。该菌株不仅具有广泛的应用前景，还因其较强的生物防治能力而被选为研究对象。研究采用多种实验方法，包括体外拮抗实验、孢子萌发抑制实验、葡萄枝条接种实验以及田间试验，全面评估了BJ-3的生物防治效果。

在体外拮抗实验中，BJ-3表现出对多种葡萄病原菌的广泛抑制能力，抑制率高达54.74%至91.62%。其中，对Diaporthe sojae（D. sojae）的抑制率最高，达到91.62%，其次是D. eres（D. eres）和Botryosphaeria dothidea（B. dothidea），抑制率分别为81.31%和76.18%。这些结果表明，BJ-3能够有效抑制多种病原菌的生长，具有较强的生物防治潜力。

在孢子萌发抑制实验中，BJ-3在4×10? CFU/mL的浓度下，经过10-12小时的培养，其对L. theobromae孢子萌发的抑制率达到98.47%。这说明该菌株在孢子萌发阶段就表现出强烈的抑制作用，可能通过竞争营养、干扰孢子膜结构等方式实现。在田间试验中，BJ-3的水分散性颗粒被用于处理感染Botryosphaeria枯萎病的葡萄园，其抑制率达到了71.94%，显示出良好的实际应用前景。

此外，研究还通过基因组挖掘，发现了BJ-3菌株中包含11个与生物防治相关的次级代谢产物合成基因簇。这些基因簇编码了多种具有抗菌活性的次级代谢产物，如bacillibactin、bacilysin、bacillaene、fengycin、subsilon、aurantinin、thailanstatin和laterocidine等。这些化合物可能通过多种机制抑制病原菌的生长，包括破坏细胞膜、改变膜通透性、干扰细胞内的离子平衡以及诱导细胞死亡等。其中，bacillibactin和surfactin等化合物被发现具有显著的抗菌和抗真菌活性，可能通过螯合铁离子或直接抑制病原菌的生长来实现生物防治效果。

研究还通过对比基因组分析，进一步确认了BJ-3的分类地位。通过计算不同菌株之间的平均核苷酸身份（ANI）和数字DNA-DNA杂交（dDDH）值，BJ-3与Bacillus halotolerans的参考菌株之间的ANI值均高于95%，且dDDH值超过92%，表明其在系统分类学上与B. halotolerans具有较高的亲缘关系。这一结果支持了BJ-3作为Bacillus halotolerans的分类归属。

在实际应用中，研究团队采用了不同的处理浓度，以评估BJ-3在不同条件下的生物防治效果。例如，在葡萄枝条接种实验中，使用1.08×10? CFU/mL的BJ-3处理，其对L. theobromae的控制效率达到74.39%。这一结果表明，BJ-3在实际应用中具有较高的生物防治效果。而在田间试验中，BJ-3水分散性颗粒在500倍稀释时表现出最高的抑制率（71.94%），进一步验证了其在自然条件下的应用潜力。

综上所述，本研究通过基因组分析、体外实验和田间试验，全面评估了BJ-3菌株在生物防治方面的潜力。其对多种病原菌的广泛抑制能力、高效的孢子萌发抑制效果以及在田间试验中表现出的显著控制效果，表明该菌株有望成为一种有效的生物防治工具。未来的研究可以进一步探索其次级代谢产物的结构和功能，优化其发酵和制剂工艺，并在多季节的田间试验中验证其长期效果，以推动其在葡萄种植业中的实际应用。