《Cryobiology》：Effects of co-supplementation of trehalose with fetuin and taxifolin in freezing extender on quality parameters of bull spermatozoa following freeze-thaw process
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甘油替代及抗氧化剂协同对牛精子解冻品质的影响，通过添加海藻糖、税ifolin和fetuin于低浓度甘油冻存剂中，显著提升精子活力、膜完整性和抗氧化能力。
摘要 甘油常被用作牛精子冷冻保存中的保护剂；然而，其细胞毒性可能会对精子质量产生负面影响。本研究旨在通过添加天然抗氧化剂（塔克西福林和费图因）以及二糖海藻糖来降低精液稀释液中的甘油浓度。从三头公牛中收集了十二份精液样本，并进行了初步评估，然后将其稀释在含有7%或4%甘油的Tris-卵黄（TEY）稀释液中。对照组使用了7%甘油的TEY稀释液，而实验组包括G7F（TEY + 费图因）、G7T（TEY + 塔克西福林）、G7M（TEY + 费图因 + 塔克西福林）以及添加了50 mM海藻糖的4%甘油组：G4（TEY + 海藻糖）、G4F（TEY + 费图因）、G4T（TEY + 塔克西福林）和G4M（TEY + 费图因 + 塔克西福林）。解冻后的评估包括精子活力、质膜完整性、顶体完整性、线粒体膜电位（MMP）、DNA片段化和氧化应激标志物的检测。G4F和G4T组的总活力和前进活力、存活率以及质膜完整性显著高于其他组（p < 0.05）。此外，这些组的丙二醛（MDA）水平显著降低，表明脂质过氧化和氧化应激减轻（p < 0.05）。因此，在含有4%甘油的冷冻保存稀释液中同时添加50 mM海藻糖、50 μM塔克西福林和5 mg/mL费图因可能有助于提高解冻后公牛精子的质量。
引言 辅助生殖技术，如人工授精（AI），对于保护动物的宝贵遗传特性至关重要[1]。精子冷冻保存是一种有用的储存技术，对公牛繁殖中的人工授精非常重要[2]。尽管精子冷冻具有显著优势，但冷冻-解冻过程会导致精子结构和功能的不可逆变化[3]。
在冷冻保存过程中，精子细胞会暴露于多种应激因素中，包括冰晶形成、渗透压冲击、脱水和由自由基产生的氧化应激[4,3]。这些活性氧（ROS）会破坏精子的活力、存活率和DNA完整性，最终导致细胞凋亡[5]。近几十年来，研究人员一直在努力通过各种方法减轻冷冻-解冻损伤[6]。这些方法包括优化稀释液成分和评估不同的冷冻保存技术（缓慢冷冻、快速冷冻和玻璃化）[7]。
标准的冷冻培养基通常含有保护剂、能量底物、蛋白质来源、pH缓冲剂以及各种添加剂，包括抗氧化剂、脂肪酸和抗生素[8]。为了减轻冷冻和解冻过程中温度波动对精子的损伤，必须将特定的化学化合物加入稀释液中。这些物质被称为保护剂，可以减少冷冻保存过程中的冰晶形成[9]。
甘油是动物和人类精子冷冻中最常用的保护剂[10,11]。将甘油加入冷冻培养基中会在质膜两侧产生渗透压差，通过水通道蛋白介导的被动运输驱动细胞内水分的流出[12]。然而，由于其对精子质膜和代谢功能的毒性和渗透效应，其应用受到限制[13]。此外，过高的甘油浓度会损害精子的功能并降低受精能力，从而降低多种动物物种精液稀释液中的繁殖效率[14]。
基于先前的研究，已将天然抗氧化剂与甘油一起加入冷冻稀释液中以降低所需的甘油浓度[15]。海藻糖是一种二糖化合物，可以防止渗透压应激，并与膜磷脂特异性相互作用[16]。此外，海藻糖可以在冷冻保存前诱导高渗状态，促进渗透脱水，从而减少细胞内冰晶的形成和相关细胞损伤[16]。在我们之前的研究中，海藻糖被用来减轻甘油的细胞毒性并在低甘油冷冻-解冻条件下保持精子质量。
除了海藻糖外，费图因——一种存在于胎牛血清中的主要糖蛋白——还具有保护作用和抗氧化特性，已被提议作为精子冷冻保存方案中甘油的替代品或辅助成分[17]。此外，塔克西福林是一种天然存在的植物黄酮类化合物，具有显著的抗氧化和抗菌活性，进一步支持其在提高精子冷冻存活率方面的应用[18,19]。将这些生物活性化合物加入精液稀释液中已被证明可以通过减轻冷冻-解冻过程中的氧化应激和细胞损伤来提高解冻后精子的质量[20]。因此，本研究旨在评估在海藻糖含量较低的精液稀释液中同时添加海藻糖、费图因和塔克西福林是否能够提高解冻后精子的质量。具体来说，目的是阐明它们在冷冻保存过程中保护精子功能完整性的潜在协同效应。
样本收集和伦理 本研究获得了乌尔米亚医科大学伦理委员会的批准（批准编号：
IR.UMSU.AEC .1401.019）。在伊朗西阿塞拜疆的Jabal繁殖中心，从三头平均年龄为四岁的西门塔尔公牛中收集了十二份精液样本，使用人工阴道采集。为了减少个体差异，这些精液样本被合并后分配到不同的实验组中。收集后，对精液质量参数进行了评估，包括体积等。
精液活力参数 图1A和B分别展示了总活力和前进活力的百分比。与对照组和其他处理组相比，G4T和G4F组的这两个参数值显著更高（P < 0.05）。然而，G4T组和G4F组之间没有显著差异。与对照组和所有处理组相比，G4组的总活力和前进活力百分比最低。讨论 精子在冷冻和解冻过程中会经历一系列物理和生化变化[26]。冷冻保存会导致膜流动性降低、膜通透性受损以及渗透阻力下降，最终影响精子的存活率和受精能力[27]。成功的冷冻保存需要在整个过程中保持精子的存活率、活力和代谢功能[28,29]。甘油是最常用的细胞内保护剂结论 我们的研究结果表明，在精液稀释液中添加4%的甘油，并结合海藻糖、塔克西福林和费图因，可以提高解冻后公牛精子的质量，特别是在活力、存活率、线粒体膜电位（MMP）和丙二醛（MDA）调节方面，优于传统的7%甘油稀释液。基于这些结果，建议配制一种含有4%甘油并添加50 mM
作者贡献声明 Mustafa Numan Bucak： 研究、概念化。Morteza Taravat： 撰写——初稿、方法学。Oya Korkmaz： 撰写——审阅与编辑、方法学。Ali Soliemanzadeh： 撰写——审阅与编辑、方法学。Mojtaba Karimpour： 方法学。Mohammad Saber Maroufi： 方法学。Neda Abedpour： 方法学。Sad?k Kü?ükgünay： 方法学、数据分析。Tohid Rezaei Topraggaleh： 监督。
资金声明 本研究得到了乌尔米亚医科大学和塞尔丘克大学的支持。作者衷心感谢这两家机构提供的财政援助，使得本研究的完成成为可能。
致谢 作者衷心感谢伊朗乌尔米亚医科大学和土耳其塞尔丘克大学在整个项目过程中提供的科学支持。同时，我们也感谢乌尔米亚精液生产中心（Jabal）的工作人员在提供本研究用公牛精液样本方面所提供的帮助。
