关于内质网-线粒体相互作用在维持冬眠达乌里亚地松鼠骨骼肌纤维中钙稳态中的作用的研究

《Cryobiology》：Research on the role of endoplasmic reticulum-mitochondria interactions in maintaining calcium homeostasis in skeletal muscle fibers of hibernating Daurian ground squirrels

本研究探讨冬眠啮齿类动物Daurian地松鼠在慢肌（SOL）和快肌（EDL）中ER-线粒体接触点（ERMCS）相关蛋白表达及钙稳态调控机制。结果显示，IBA组SOL肌肉MFN2、GRP75、VDAC1表达显著上调，且Ca2?轴复合物相互作用增强，而EDL肌肉未见显著变化，提示慢肌通过增强ERMCS介导的钙转运维持稳态，可能为冬眠肌保护机制。

　　在长时间的静止状态下，维持细胞质钙离子的稳态是某些冬眠动物抵抗因不活动导致的肌肉萎缩的关键策略。然而，尽管已知内质网（ER）与线粒体之间的相互作用在细胞钙离子调控中起着重要作用，但这些相互作用是否在冬眠期间的骨骼肌纤维中参与维持钙离子稳态，目前仍不清楚。为了探索这一问题，我们系统地研究了在Daurian地鼠（Spermophilus dauricus）冬眠期间，股四头肌（EDL）和腓肠肌（SOL）中内质网-线粒体接触点（ERMCS）的连接蛋白、钙离子轴相关蛋白以及参与钙离子运输的蛋白复合物的表达情况。研究结果表明，在间期唤醒（IBA）组中，SOL肌肉中的连接蛋白MFN2以及钙离子轴相关蛋白GRP75和VDAC1的表达显著增加，同时钙离子轴复合物内的相互作用也有所增强。相比之下，在冬眠后期（LT）组中并未观察到这些变化。此外，EDL肌肉在冬眠周期中并未表现出类似的显著变化。这些发现提示，内质网与线粒体之间的相互作用可能在骨骼肌纤维中参与维持钙离子稳态，特别是在慢肌纤维中。

细胞质钙离子的稳态是细胞功能调控的重要组成部分，它在生理条件下维持着动态平衡。然而，长时间的不活动可能会打破这种平衡，导致细胞质中钙离子的过载。过量的钙离子会激活钙蛋白酶系统，进而降解骨骼肌中的结构蛋白。随后，分离的肌原纤维蛋白通过ATP依赖的泛素-蛋白酶体途径被降解，最终导致肌肉结构的退化和萎缩。这种由钙离子稳态破坏引发的蛋白降解机制已经被证实是非冬眠动物中因不活动导致肌肉萎缩的关键因素。已有研究表明，在Daurian地鼠的骨骼肌纤维中，间期唤醒阶段的细胞质钙离子水平升高，但经过短暂的唤醒期（约24小时）后有所恢复，并在冬眠结束后完全恢复至夏季活跃状态。这种恢复表明，冬眠动物在骨骼肌中具备维持钙离子稳态的有效机制，而周期性的唤醒在这一过程中起着重要作用。这些适应性可能代表了冬眠动物抵抗不活动导致肌肉萎缩的重要策略。更为重要的是，内质网和线粒体在这一过程中都发挥着关键作用，主要通过调控钙离子运输蛋白，如内质网中的钙离子释放通道ryanodine receptor（RYR）、肌浆网中的钙离子泵sarcoplasmic reticulum Ca2? pump（SERCA）、钙离子结合蛋白calsequestrin（CSQ）、线粒体中的钙离子单向转运蛋白（MCU）复合物以及leucine zipper-EF-hand-containing transmembrane protein 1（Letm1），从而在冬眠期间抑制钙蛋白酶系统的激活。

大量的研究证据表明，细胞器并不是孤立运作的，而是通过相互作用来调控细胞内的钙离子稳态。作为细胞内主要的钙离子储存场所，内质网和线粒体通过特殊的区域——内质网-线粒体接触点（ERMCS）——共享大约20%的表面积。ERMCS在内质网和线粒体之间的钙离子传递以及细胞质钙离子稳态中发挥着至关重要的作用。这些区域富含关键蛋白，如位于内质网膜上的钙离子释放通道inositol-1,4,5-triphosphate receptor（IP3R）和位于线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）。IP3R和VDAC1通过葡萄糖调节蛋白75（GRP75）连接，形成“IP3R1-GRP75-VDAC1”钙离子轴，这有助于内质网和线粒体之间的钙离子传递。当受到刺激时，增加的inositol-1,4,5-triphosphate（IP3）会结合到激活的IP3R上，从而引发内质网中钙离子的释放，并在ERMCS中形成局部高钙离子微环境，进一步促进内质网钙离子的释放和线粒体钙离子的摄入，通过正反馈机制增强两个细胞器之间的钙离子传递。这种通过钙离子轴从ERMCS向线粒体传递钙离子的过程有助于缓解细胞质中的钙离子过载。

鉴于冬眠动物在骨骼肌纤维中维持钙离子稳态的卓越能力，以及内质网和线粒体在这一过程中的关键作用，我们推测，内质网与线粒体之间的相互作用可能在Daurian地鼠冬眠期间的骨骼肌纤维中发挥重要作用。为了验证这一假设，我们进行了全面的研究，评估了在不同冬眠状态（包括夏季活跃、预冬眠、冬眠后期、间期唤醒和冬眠后）下，SOL和EDL肌肉中ERMCS的连接蛋白MFN2、钙离子轴相关蛋白GRP75和VDAC1的表达情况，以及钙离子轴复合物内的相互作用。这项研究旨在阐明内质网-线粒体相互作用在Daurian地鼠冬眠期间骨骼肌钙离子稳态维持中的作用。

在实验过程中，所有动物实验均获得中国西北大学动物实验伦理委员会的批准（许可编号：SYXK 2010-004）。研究中使用的Daurian地鼠于2023年4月和5月从中国陕西省渭南地区捕捉。捕捉后，这些地鼠被转移至Daurian地鼠饲养设施，以半自由放养的方式饲养，持续有水和饲料供应。为了确保实验的准确性，我们对ERMCS的纯度进行了评估。ERMCS的分离过程如图2A所示，通过检测质膜标记蛋白PMCA，我们确认其仅在匀浆中表达，而在粗线粒体部分、ERMCS或细胞质样本中均未检测到PMCA的表达（图2B）。此外，线粒体标记蛋白VDAC1在匀桨、粗线粒体和ERMCS中均表达，而在细胞质中未检测到，这进一步证明了粗线粒体和ERMCS与细胞质部分的成功分离。

研究结果表明，在间期唤醒阶段，SOL肌肉中连接蛋白MFN2的表达显著增加，同时钙离子轴相关蛋白GRP75和VDAC1的表达也有所增强。此外，钙离子轴复合物内的相互作用也增强。这提示，在冬眠周期中，SOL肌肉中的内质网-线粒体相互作用可能在维持钙离子稳态中发挥关键作用。相比之下，在EDL肌肉中并未观察到类似的显著变化。这可能与SOL和EDL肌肉在功能上的差异有关，SOL肌肉作为慢肌纤维，其代谢方式和对钙离子的需求可能与EDL肌肉不同。因此，在维持钙离子稳态方面，慢肌纤维可能比快肌纤维更依赖于内质网与线粒体之间的相互作用。

在讨论研究结果时，我们发现，钙离子稳态的破坏是导致非冬眠动物肌肉萎缩的重要因素。相比之下，冬眠动物在长时间的不活动状态下仍能有效维持钙离子稳态。研究显示，在冬眠后期和间期唤醒阶段，骨骼肌纤维中的细胞质钙离子水平有所升高，但在唤醒和重新进入冬眠状态后，这些水平会恢复至夏季活跃状态。这种动态变化表明，细胞质钙离子的调控在冬眠周期中是一个持续的过程。这可能意味着，冬眠动物通过特定的生理机制，在不活动期间保持钙离子的动态平衡，从而避免钙离子过载引发的肌肉损伤。

此外，研究还表明，ER和线粒体之间的相互作用在维持钙离子稳态方面具有重要作用。特别是在间期唤醒阶段，这些相互作用的增强可能有助于细胞质钙离子的调控。这可能与冬眠动物在唤醒阶段的代谢活动增加有关，此时细胞需要更多的能量和营养物质，而钙离子在细胞代谢中起着关键作用。因此，在唤醒阶段，通过增强内质网与线粒体之间的钙离子传递，可能有助于维持细胞的正常功能，并防止因钙离子过载导致的肌肉萎缩。

然而，尽管研究结果提供了有力的证据，但仍然需要进一步的实验来验证这些相互作用的功能性。目前，我们主要通过检测相关蛋白的表达水平和相互作用来评估其在维持钙离子稳态中的作用，但直接的功能验证实验仍需进行。例如，可以通过干扰这些蛋白的表达或功能，观察其对钙离子稳态和肌肉萎缩的影响。这将有助于更深入地理解内质网与线粒体之间的相互作用在冬眠动物骨骼肌中的具体机制。

本研究的局限性在于，虽然我们检测了一系列生化参数，并提供了内质网-线粒体接触点在冬眠期间骨骼肌钙离子稳态调控中的作用证据，但尚未进行直接的功能验证实验。因此，未来的研究可以进一步探讨这些蛋白在维持钙离子稳态中的具体作用，以及它们如何影响肌肉结构和功能。此外，研究的样本量可能有限，未来可以扩大样本数量，以提高研究结果的统计学意义和可靠性。

本研究的作者贡献如下：张杰负责撰写原始稿件和进行实验调查；潘芳阳负责项目管理、实验调查和数据整理；何悦负责实验方法的设计和实验调查；赵静负责项目管理和实验方法设计；白晓卓负责实验验证和实验调查；魏燕鸿负责实验调查；高云芳负责撰写和编辑稿件，并负责研究的构思。研究的数据可以通过合理请求从通讯作者处获得。本研究没有涉及任何竞争利益。最后，本研究得到了中国国家自然科学基金（32070442）、山西省基础研究计划（202303021212126）以及宁夏医科大学特殊人才计划（XT2019006）的支持。这些资金支持为本研究的顺利进行提供了保障，同时也为未来进一步探索冬眠动物骨骼肌钙离子稳态的调控机制奠定了基础。