富含氢的气体能够提高Caco-2细胞在缺血-再灌注损伤后的线粒体膜电位，并促进呼吸功能的恢复

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Hydrogen-rich gas enhances mitochondrial membrane potential and respiratory function recovery in Caco-2 cells post-ischemia-reperfusion injury

本研究探讨分子氢（H?）对缺血再灌注（I/R）损伤中肠道细胞线粒体功能的影响。通过建立缺氧-复氧模型，发现H?能显著恢复线粒体膜电位、提高ATP产量，并抑制ROS生成及凋亡信号通路，同时下调HIF1α和PDK1表达，从而改善I/R损伤。结果为H?在临床应用提供了机制支持。

　　

清柳美月（Mizuki Seya）|青影敏之（Toshiyuki Aokage）|孟颖（Ying Meng）|平山隆弘（Takahiro Hirayama）|小原隆文（Takafumi Obara）|野岛刚（Tsuyoshi Nojima）|吉野典则（Kosaki Yoshinori）|湯本哲也（Tetsuya Yumoto）|渡边明宏（Akihiro Watanabe）|山田泰平（Taihei Yamada）|内藤宏道（Hiromichi Naito）|中尾淳典（Atsunori Nakao）

日本冈山大学医学、牙科和药学研究生院急诊、重症监护与灾难医学系

摘要

背景

缺血-再灌注（I/R）损伤会引发氧化应激，导致高度敏感的肠道组织受损。分子氢（H₂）在I/R损伤中显示出治疗潜力，我们之前的研究已经证明了其在改善大鼠肠道移植模型中的效果。然而，其对线粒体功能的影响尚未得到充分了解。本研究旨在阐明H₂如何调节因I/R损伤而受损的线粒体功能。

方法

为了评估H₂对I/R损伤的影响，将细胞分为三组：对照组、缺氧组（99% N₂、1% O₂，不添加H₂，分别处理3小时、6小时或24小时），以及缺氧-H₂组（99% H₂、1% O₂，处理相同的时间。处理后，细胞在常氧条件下（21% O₂）再氧化1小时、2小时、4小时或6小时。测量线粒体膜电位、氧气消耗量和ATP生成量。同时检测活性氧的产生以及凋亡和代谢调节因子。

结果

H₂显著促进了I/R损伤后的线粒体恢复，通过增强ATP生成、恢复线粒体膜电位和改善氧气消耗量来实现。它还降低了ROS水平并抑制了促凋亡信号通路。值得注意的是，H₂抑制了HIF1α和PDK1的表达，表明H₂可能在线粒体缺氧驱动的信号通路的上游起作用。这些变化在再灌注期间促进了氧化磷酸化及整体细胞功能。

结论

我们的研究结果表明，H₂疗法能够支持线粒体功能，抑制ROS，并调节I/R损伤中的缺氧驱动通路。这些发现加深了人们对H₂在应对I/R损伤方面潜力的理解，为其在其他缺氧相关疾病中的应用奠定了基础。

引言

线粒体是细胞内能量产生的主要场所，这一过程严重依赖于氧气。在缺血条件下——如心肌梗死、中风或移植过程中供体器官的血流暂时中断——血液循环的停止会导致氧气供应中断，从而迅速引发细胞损伤和器官坏死。尽管早期再灌注旨在恢复氧气供应并减轻缺血损伤，但反而会通过炎症、钙超载和氧化应激等机制进一步损害线粒体。这一连锁反应会损害线粒体功能，破坏ATP生成，并促进凋亡，构成了缺血-再灌注（I/R）损伤的基础[[1], [2], [3]]。

在众多器官中，肠道特别容易受到I/R损伤。这是因为肠道上皮细胞需要大量ATP来进行主动营养转运，而这一过程依赖于氧气[4,5]。此外，这些细胞的更新速率很快，每3-5天就会更新一次[6,7]。为了维持这种持续再生，它们需要稳定的氧气供应。由于这些细胞消耗大量氧气，它们在代谢过程中也会产生活性氧（ROS）。在I/R过程中，过量的ROS会产生，超过抗氧化防御系统的处理能力，导致线粒体功能障碍、DNA和膜氧化损伤，并进一步引发ROS的自我放大循环[5,8]。这会损害快速分裂的上皮细胞，减缓再生过程并削弱肠道屏障。因此，肠道更容易受到损伤，突显了基于抗氧化策略保护线粒体功能并减轻I/R诱导损伤的潜力。

最近的进展发现了几种在调节I/R损伤期间生理反应中起关键调控作用的气体分子，它们具有强大的抗炎、抗凋亡和抗氧化作用[2,[9], [10], [11]]。值得注意的是，分子氢（二氢，H₂）因其抗氧化特性而受到关注，并已在多种疾病模型中被证明具有治疗潜力[[12], [13], [14]]。在肝脏和肺部I/R损伤模型中，H₂通过降低炎症标志物、减轻脂质过氧化和减少氧化损伤来减轻组织损伤[13,14]。使用含H₂的保存液和吸入H₂的肠道移植模型也减弱了促炎和促凋亡的分子反应，并保持了移植后的体外空肠肌肉收缩能力[12,15,16]。作为一种临床可行的方法，我们还发现经腔内给予富含H₂的盐水可以改善黏膜通透性，减少促炎细胞因子的上调，并调节大鼠肠道移植后跨膜蛋白的丢失[12]。

虽然分子H₂在对抗I/R损伤中的有益作用已有充分记录，但其具体机制，尤其是对线粒体功能的影响机制仍不明确。因此，本研究旨在探讨H₂如何通过调节线粒体来减轻I/R损伤。我们使用了一种培养细胞模型，通过将细胞从1%氧气环境恢复到常氧环境来评估H₂对保护肠道组织免受I/R损伤的作用，重点关注其定位和功能参与。

部分片段

细胞

人类结直肠腺癌细胞（Caco-2）（ATCC. Manassas, Virginia, USA）在含有4 mM谷氨酰胺（Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, Massachusetts, U.S）、1%青霉素-链霉素（Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, Massachusetts, U.S）和10%胎牛血清（Cytiva. Marlborough, Massachusetts, USA）的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。

H₂抑制再灌注后细胞内活性氧的增加

为了研究I/R对ROS水平的影响，我们分析了在缺氧环境中培养6小时后的Caco-2细胞在再灌注30分钟和6小时后的HPF水平。先前关于H₂对ROS影响的研究表明，H₂可选择性地清除羟基自由基，但不会减少其他类型的自由基，如O₂^?和H₂O₂[18]。初步观察显示，对照组和实验组之间的HPF水平没有显著差异。

讨论

本研究表明，在缺氧期间使用H₂可以减轻由缺氧-再氧化引起的细胞损伤。即使在再氧化后6小时，暴露于缺氧中的细胞其线粒体膜电位的恢复仍然较差。然而，在缺氧期间加入H₂后，线粒体膜电位的恢复显著改善。这是首次使用实际缺氧舱模拟缺氧环境并评估H₂效果的研究。

我们的气体舱

CRediT作者贡献声明

清柳美月（Mizuki Seya）：撰写原始稿件、进行研究、进行数据分析、概念构思。青影敏之（Toshiyuki Aokage）：撰写和编辑、监督项目、制定方法、进行研究、进行数据分析、概念构思。孟颖（Ying Meng）：进行研究、进行数据分析。平山隆弘（Takahiro Hirayama）：撰写和编辑、监督项目。小原隆文（Takafumi Obara）：撰写和编辑、监督项目。野岛刚（Tsuyoshi Nojima）：撰写和编辑

数据声明

本研究生成和分析的数据集可应要求向通讯作者索取。

资助

本研究得到了JSPS KAKENHI（项目编号：JP23K15617）的资助。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：吉野典则（Kosaki Yoshinori）表示获得了JSPS KAKENHI的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文所述工作的财务利益或个人关系。