组蛋白乙酰转移酶抑制剂对小鼠模型中耳胆脂瘤的影响

《Auris Nasus Larynx》：Effect of histone acetyltransferase inhibitor against middle ear cholesteatoma in mouse model

研究探讨了人胆固醇瘤组织中H3K27ac与p300的表达及其共定位，并通过p300抑制剂C646抑制KGF诱导的胆固醇瘤小鼠模型中的细胞增殖，为胆固醇瘤治疗提供新靶点。

　　

秋山直太郎|山本-福田智美|小岛博美

日本千叶县东京牙科大学市川综合医院耳鼻喉科

摘要

目的

中耳胆脂瘤（Cholesteatoma）由增殖的上皮细胞构成。在之前的研究中，我们发现与高转录活性相关的组蛋白H3第27位赖氨酸的乙酰化（H3K27ac）在胆脂瘤中积累。在本研究中，我们首先调查了人类胆脂瘤组织中H3K27ac和组蛋白乙酰转移酶p300的表达情况，随后探讨了p300抑制剂C646对胆脂瘤生长的影响。

方法

使用抗p300和抗H3K27ac抗体对人类胆脂瘤标本进行了免疫组化分析；在给予p300抑制剂后，还使用抗p300、抗H3K27ac和抗Ki67抗体对KGF诱导的胆脂瘤小鼠模型进行了分析。

结果

在人类胆脂瘤标本中，p300的表达水平显著升高，并与H3K27ac共定位。此外，在KGF诱导的胆脂瘤小鼠模型中，C646降低了胆脂瘤细胞的增殖活性。

结论

我们的研究表明，抑制H3K27ac可能是一种治疗胆脂瘤的新策略。

引言

中耳胆脂瘤（Cholesteatoma）的特征是病变区域由角化复层鳞状上皮细胞构成，这些细胞周围堆积着角蛋白，周围伴有炎症性肉芽组织[1,2]。这种病理状况通常伴随着上皮下结缔组织和肉芽组织，其中富含淋巴细胞和成纤维细胞[1]。胆脂瘤的一个显著病理特征是上皮细胞的活跃增殖，这种增殖受到多种生长因子的刺激，尤其是角质形成细胞生长因子（KGF）[1]。

表观遗传学是一种在不改变DNA序列的情况下调节基因表达的机制，与发育、再生和多种疾病密切相关[3]。最近的研究越来越多地关注转录调控，特别是表观遗传修饰，以阐明胆脂瘤的分子病理生理机制[4]。表观遗传学的关键调控机制包括DNA甲基化和组蛋白修饰[3]。组蛋白是基本蛋白质，由核小体组成，负责在细胞核中储存DNA[3]。组蛋白尾部（即组蛋白蛋白的N端和C端区域，不包括在核心区域内）会经历多种翻译后修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化，以调节染色质功能[3]。已知组蛋白乙酰化可以通过破坏核小体和染色质结构来诱导基因激活[4]。这种表观遗传事件在慢性炎症性疾病中与促炎基因的转录密切相关[4]。其中，组蛋白H3第27位赖氨酸的乙酰化（H3K27ac）对转录激活至关重要[5]。具体而言，已在人类胆脂瘤组织中证实H3K27ac的表达水平显著升高[4]。H3K27ac是活跃增强子的关键标志物，可用于区分活跃增强子和潜在增强子[4]。在之前的研究中，我们在体外和体内胆脂瘤模型中证明了H3K27ac的上调[4]。使用重组人KGF处理培养的中耳上皮细胞时，H3K27ac的水平升高[4]。我们通过将KGF载体转染到小鼠外耳道中建立了胆脂瘤模型[1]。该模型表现为以鼓膜和耳道复层鳞状上皮为衬里的囊状结构，伴有增厚的上皮下组织和角蛋白碎片[1]。在该模型中也观察到了H3K27ac的表达增加[4]。这些结果表明，KGF信号传导可诱导H3K27ac的表达，而H3K27ac的激活对于胆脂瘤的发病机制至关重要。

组蛋白乙酰转移酶p300是已知的重要增强子定位标志物，p300与H3K27ac在活跃增强子处的共定位强烈表明p300在增强子激活中的作用[6]。此外，研究表明p300在H3K27的乙酰化过程中起着关键作用[6]。因此，我们假设H3K27ac对胆脂瘤的形成至关重要，控制其上游因子p300可能是一个潜在的新治疗靶点。为验证这一假设，我们研究了人类胆脂瘤标本中p300和H3K27ac的定位以及p300的表达水平，并在胆脂瘤小鼠模型中进行了p300抑制剂C646的抑制实验，同时使用抗p300、抗H3K27ac和抗Ki67抗体进行了免疫组化分析。

患者信息

本研究中的软部胆脂瘤病例包括17名男性和3名女性（共20例），年龄范围为16–71岁，平均年龄为41岁。分析所用组织来自2009年2月至2021年5月期间在慈惠大学医院耳鼻喉科接受手术治疗的胆脂瘤患者。手术过程中采集的正常皮肤也作为对照（8名男性和3名女性，共11例，年龄范围为32–86岁，平均年龄为59岁）。

人类胆脂瘤标本中H3K27ac和p300的免疫组化分析及p300的表达水平

在人类胆脂瘤标本中，H3K27ac阳性细胞数量增加，并且在双荧光染色中p300与H3K27ac共定位（图2A）。另一方面，正常皮肤中的p300表达水平低于胆脂瘤标本（图2A和2B）。然而，在胆脂瘤和正常皮肤组织中都观察到一些H3K27ac阳性细胞并未与p300明显共定位。胆脂瘤中p300的标记强度（LI）显著增加。

讨论

目前已知在多种疾病中基因表达受到表观遗传调控，研究表明胆脂瘤中H3K27ac表达上调，导致转录活性增强[3–5]。在本研究中，我们重点研究了组蛋白乙酰转移酶p300，分析了其表达情况并进行了抑制实验。对人类胆脂瘤组织进行H3K27ac和p300的双荧光染色显示H3K27ac表达增加，且两者共定位。

披露声明

本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）的科学研究资助（编号JP19K09857和JP22K09753，资助对象为山本-福田；编号JP18K16908和JP22K09754，资助对象为秋山）。作者没有其他需要披露的财务关系或利益冲突。

作者贡献

研究概念和设计由N.A.和T.YF共同完成。数据采集、分析和解释也由N.A.和T.YF完成。手稿起草由N.A.完成。手稿的最终修订由N.A.、T.YF和H.K共同完成。项目的监督和管理由N.A.和T.YF负责。所有作者均符合ICMJE作者标准。

资金支持

本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）的科学研究资助（编号JP18K16908和JP22K09754，资助对象为秋山；编号JP19K09857和JP22K09753，资助对象为山本-福田）。