《Archives of Biochemistry and Biophysics》：TNF promotes osteoclastogenesis by secreting
miR-31-5p into small extracellular vesicles via the autotaxin–LPA–LPAR1 axis in arthritic fibroblast-like synoviocytes
编辑推荐：
纤维母细胞样滑膜细胞（FLSs）分泌的小外泌体（sEVs）通过携带miR-31-5p等骨吸收相关miRNAs靶向LATS2促进破骨细胞分化，揭示TNF-α和LPA激活的FLSs通过自体taxin-LPA-LPAR1轴调控sEV介导的骨破坏机制。
Thanh Nam Phan|Minju Gal|Okhwa Kim|Hoang Long Le|Cheol Hwangbo|Jeong-Hyung Lee
韩国江原国立大学自然科学学院生物化学系，春川，24341
摘要
成纤维细胞样滑膜细胞（FLSs）在关节炎的发病机制中起着关键作用。然而，FLSs分泌的小型细胞外囊泡（sEVs）对破骨细胞生成的影响尚未完全明了。在本研究中，我们旨在探讨肿瘤坏死因子（TNF）和溶血磷脂酸（LPA）激活的FLSs在sEV介导的破骨细胞生成相关miRNA释放中的作用，并阐明其功能贡献。用LPA或TNF刺激SW982细胞显著增加了sEV的分泌。TNF上调了autotaxin的表达并促进了sEV的释放；然而，通过小干扰RNA（siRNA）敲低LPAR1减弱了TNF–autotaxin–LPA轴诱导的sEV释放增加。值得注意的是，TNF或LPA的刺激增加了syntenin-1的表达，但并未改变其mRNA水平。此外，敲低syntenin-1基因（SDCBP）抑制了LPA诱导的sEV释放增加，表明syntenin-1可能介导TNF–autotaxin–LPA–LPAR1轴诱导的sEV分泌。来自TNF或LPA处理的SW982细胞的sEVs能够刺激破骨细胞的生成。我们鉴定出miR-31-5p是富含在sEVs中的破骨细胞生成相关miRNA。来自TNF和LPA刺激的类风湿性关节炎（RA）FLSs的sEVs中的miR-31-5p表达水平显著高于未受刺激的RA FLSs中的表达水平。用miR-31-5p模拟物处理可增强破骨细胞的生成，因为它靶向了大肿瘤抑制激酶2（LATS2），而其抑制剂则抑制了sEV介导的破骨细胞生成促进作用。这些发现揭示了TNF和LPA激活的FLSs可能通过sEV介导将破骨细胞生成相关miRNA（如miR-31-5p）传递给破骨细胞前体，从而促进破骨细胞的形成和骨破坏的机制。
引言
成纤维细胞样滑膜细胞（FLSs）是位于关节滑膜衬里的特化细胞，是类风湿性关节炎（RA）和骨关节炎（OA）等关节炎疾病发展和进展的关键因素[1]、[2]。FLSs是绒毛膜-软骨交界处最丰富的细胞类型[2]、[3]。在绒毛膜中，激活的FLSs分泌趋化因子，招募单核细胞并促进其分化为巨噬细胞。这些巨噬细胞通过分泌促炎细胞因子参与自我持续的循环，这是慢性炎症的主要驱动因素[3]、[4]。激活的FLSs还通过诱导破骨细胞生成和抑制成骨细胞生成在骨破坏中起关键作用[5]、[6]。肿瘤坏死因子（TNF）是参与RA发病机制的主要细胞因子，TNF抑制剂是治疗该疾病的有效药物[7]、[8]。溶血磷脂酸（LPA）是一种由autotaxin（由ENPP2基因编码）酶产生的生物活性磷脂，在RA的发展中也起着关键作用[9]、[10]。LPA与TNF协同作用，诱导炎症反应，从而促进RA中的FLSs激活，最终导致慢性炎症、关节损伤和骨破坏[11]、[12]。
细胞外囊泡是由大多数细胞类型释放到细胞外空间的纳米级磷脂双层包裹的囊泡。小型细胞外囊泡（sEVs），通常称为外泌体，直径一般在40–160纳米之间[13]、[14]。它们是在内体限制膜内陷和管腔内囊泡形成过程中产生的，形成称为多囊泡体（MVBs）的特化内体结构。这些MVBs随后与质膜融合并通过胞吐作用作为sEVs释放[13]、[14]。sEVs通过将DNA、RNA、miRNA、脂质和蛋白质等生物活性分子传递给受体细胞，发挥细胞间通讯的媒介作用[14]、[15]。sEVs及其携带的miRNA与关节炎的病理进展密切相关，通过调节细胞增殖、自噬、骨破坏、血管生成和免疫反应[16]。例如，TNF刺激FLSs分泌miR-221-3p到sEVs中，从而通过靶向DKK2抑制成骨细胞的生成[17]。来自RA FLSs的sEVs中的miR-200a-3p促进迁移、侵袭和血管生成，而来自炎症性关节炎患者的sEVs则增强破骨细胞的分化[18]、[19]。然而，FLSs来源的sEVs及其携带的miRNA调节破骨细胞分化的具体功能和机制仍有待阐明。
在本研究中，我们旨在探讨TNF和LPA如何增强sEV介导的破骨细胞生成相关miRNA的释放，进而调节破骨细胞的形成。我们证明了TNF–autotaxin–LPA–LPAR1轴通过将包括miR-31-5p在内的破骨细胞生成相关miRNA包装到sEVs中来促进破骨细胞分化，并且sEVs中的miR-31-5p通过靶向大肿瘤抑制激酶2（LATS2）促进破骨细胞的生成。
部分摘录
细胞和细胞培养
RAW264.7巨噬细胞和SW982（HTB 93）人滑膜肉瘤细胞购自美国马纳萨斯的美国类型培养收集中心（American Type Culture Collection）。人RA FLSs（#408RA 05a）购自Cell Applications, Inc.（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。细胞在添加了10%胎牛血清（Biowest）和1%青霉素-链霉素溶液（Thermo Fisher Scientific，华盛顿州沃尔瑟姆）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Biowest，佛罗里达州布拉登顿）中培养。细胞在37℃下孵育TNF通过autotaxin-LPA-LPAR1轴刺激SW982细胞分泌sEV
为了研究TNF和LPA对关节炎FLSs中sEV分泌的影响，我们使用了SW982细胞系，该细胞系是炎症性关节炎的模型[22]、[23]。NTA结果显示，用LPA处理SW982细胞后，sEVs（直径50–200纳米）的浓度高于未经处理的对照细胞（图1A）。Western blot分析表明，LPA刺激并未改变全细胞裂解物中sEV标记蛋白ALIX、CD63和TSG101的表达，但增加了
讨论
sEVs是富含多种生物分子的丰富细胞外囊泡，充当细胞间通讯的载体[15]、[28]。在滑膜微环境中，sEVs通过运输各种生物分子（包括miRNA）在细胞间通讯和关节炎的发病机制中发挥关键作用[16]、[29]。sEVs中的miRNA可以显著影响FLSs、免疫细胞和其他滑膜微环境中的细胞类型的行为
CRediT作者贡献声明
Okhwa Kim：验证、方法学、研究。Hoang Long Le：可视化、方法学、数据管理。Cheol Hwangbo：写作 – 审稿与编辑、验证、研究。Jeong-Hyung Lee：写作 – 审稿与编辑、监督、概念化。Thanh Nam Phan：写作 – 初稿撰写、可视化、方法学、数据分析、数据管理。Minju Gal：可视化、方法学、数据分析、数据管理
伦理批准
所有关于动物实验程序、处理和护理的程序和方案均经过江原国立大学机构动物护理和使用委员会（批准编号KW-231117-2）的审查和批准。
数据可用性
本研究生成或分析的所有数据均包含在文章中。如需进一步信息或请求使用这些数据，请联系相应作者。资助
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助（NRF-2020R1A5A8019180）。利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
