传染性造血坏死病毒糖蛋白中第67位和第438位的氨基酸发生联合突变后，其致病性会进一步降低

《Aquaculture》：Combined amino acid mutations in position 67 and 438 in the glycoprotein of infectious hematopoietic necrosis virus can further reduce the pathogenicity

本研究通过同时突变IHNV G蛋白的67和438位氨基酸，成功开发减毒疫苗rIHNV-G67-438，使虹鳟鱼存活率达88.9%，并引发显著免疫应答（IL1β/IFN1/IL8/TNF-α/MX1/TLR3上调），抑制病毒复制，为IHN防控提供新策略。

　　近年来，随着水产养殖业的快速发展，鱼类传染病对养殖业构成了重大威胁。其中，传染性造血组织坏死病（Infectious Hematopoietic Necrosis, IHN）是由传染性造血组织坏死病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis Virus, IHNV）引起的一种严重疾病，尤其对虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）等重要养殖品种造成巨大影响。在中国，由于IHNV的传播，自1985年以来，特别是在辽宁、甘肃和青海等地，虹鳟鱼养殖业曾遭受严重打击，甚至一度接近崩溃。IHN病毒具有高度传染性，当水温在10–12°C时，幼鱼的死亡率可达70–100%。这种高致死率不仅威胁到了虹鳟鱼的生存，也对养殖业的经济效益造成了严重影响。

面对IHN带来的挑战，科学界一直在探索有效的防控措施。其中，疫苗的研发被认为是最重要的手段之一。然而，目前尚无广泛应用的疫苗能够有效控制IHNV的传播和感染。因此，研究如何通过基因改造技术开发更安全、有效的疫苗成为当务之急。IHNV是一种子弹状、单链RNA病毒，具有负链特性，其基因组由六个主要蛋白组成：核蛋白（N）、磷酸蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）、大RNA依赖性RNA聚合酶（L）以及非病毒蛋白（NV）。其中，糖蛋白（G）在病毒的致病性中扮演着关键角色，它不仅参与病毒的吸附、内吞和复制过程，还能够诱导机体产生中和抗体，是疫苗研发中的重要靶点。

研究发现，IHNV的糖蛋白中存在多个抗原位点，这些位点对病毒的致病性和免疫反应具有重要影响。通过对糖蛋白中特定氨基酸位点的突变，可以有效降低病毒的致病性，同时增强宿主的免疫应答。例如，有研究表明，对狂犬病毒（Rabies Virus, RABV）的糖蛋白进行特定位置的突变，可以显著降低其致病性，提高疫苗的安全性和有效性。同样，在IHNV的研究中，科学家发现对糖蛋白的第438位（Asn438→Ala438）进行突变可以显著提高虹鳟鱼的存活率。此外，对糖蛋白的第67位（Asp67→Glu67）进行突变也进一步降低了IHNV的致病性。基于这些发现，研究者提出了一个假设：通过同时对糖蛋白的第67位和第438位进行突变，可以协同降低IHNV的致病性，并增强疫苗在免疫鱼中的保护效果。

本研究中，科学家利用反向遗传学技术，成功构建了三种含有不同糖蛋白突变的重组IHNV病毒（rIHNV-G67、rIHNV-G438和rIHNV-G67–438）。通过在体外实验中分析这些重组病毒的生物学特性，并在虹鳟鱼中进行攻毒试验，研究人员发现rIHNV-G67–438的生长特性与原始病毒株（wtIHNV-HLJ09）相似，但在感染后表现出显著降低的致病性。此外，rIHNV-G67–438在体外实验中诱导了较少的细胞凋亡，并且降低了caspase-3和caspase-9的活性。这表明该病毒在感染过程中对宿主细胞的破坏性较低，从而减少了疾病的发生风险。

在疫苗接种实验中，研究人员发现，接种rIHNV-G67–438的虹鳟鱼在IHNV感染后表现出显著的保护效果，其相对存活率（Relative Percent Survival, RPS）达到了约88.9%，优于其他接种组。同时，该疫苗还显著提高了虹鳟鱼体内特异性IgM抗体的水平，表明其能够有效激活宿主的免疫系统。值得注意的是，在疫苗接种的早期阶段，虹鳟鱼体内迅速激活了抗病毒免疫反应，表现为IL1β、IFN1、IL8、TNF-α、MX1和TLR3等基因的表达水平显著上升。这些基因的上调表明宿主的免疫系统能够快速识别并响应疫苗中的病毒成分，从而形成有效的免疫屏障。

此外，研究还发现，接种rIHNV-G67–438的虹鳟鱼体内IHNV的基因组载量显著低于其他组。这表明该疫苗不仅能够增强宿主的免疫应答，还能够有效抑制病毒的复制和传播。这些结果进一步支持了该疫苗在降低病毒致病性方面的潜力，同时也为IHNV的防控提供了新的思路。

本研究的发现不仅对IHN的防控具有重要意义，还为理解副粘病毒（Rhabdovirus）的致病机制和开发减毒疫苗提供了新的视角。通过同时对糖蛋白的两个关键位点进行突变，研究人员成功开发出一种减毒的IHNV疫苗，该疫苗在保持病毒复制能力的同时，显著降低了其致病性。这种策略为未来疫苗的设计提供了参考，即通过基因工程手段调整病毒的关键蛋白，使其既能诱导免疫反应，又不会对宿主造成严重伤害。

在实际应用中，该疫苗的开发对于保障虹鳟鱼养殖业的可持续发展具有重要价值。随着全球范围内对水产品需求的增加，虹鳟鱼作为一种高经济价值的养殖品种，其健康状况直接关系到整个水产养殖业的稳定。然而，IHN病毒的高致病性和传播性使得虹鳟鱼养殖面临巨大风险。因此，开发有效的疫苗不仅能够减少疾病的发生，还能降低经济损失，提高养殖效率。

本研究中，科学家通过严谨的实验设计和数据分析，验证了该疫苗的有效性。首先，通过反向遗传学技术构建了三种含有不同突变的重组病毒，随后在体外实验中分析了它们的生长特性，发现rIHNV-G67–438的生长曲线与原始病毒株相似，但其在感染后表现出更低的致病性。这表明该病毒在保持其复制能力的同时，显著降低了其对宿主的破坏性。其次，在体内实验中，研究人员通过攻毒试验评估了该疫苗在虹鳟鱼中的保护效果，发现接种rIHNV-G67–438的鱼在IHNV感染后表现出更高的存活率，且其体内的病毒载量显著低于其他组。这表明该疫苗能够有效抑制病毒的复制，同时增强宿主的免疫应答。

此外，研究还发现，接种该疫苗的虹鳟鱼体内特异性IgM抗体水平显著上升，表明其能够有效激活免疫系统。同时，在疫苗接种的早期阶段，虹鳟鱼体内迅速激活了抗病毒免疫反应，表现为多个免疫相关基因的表达水平显著上升。这些基因的上调不仅有助于宿主抵抗病毒的感染，还可能为未来的疫苗开发提供新的靶点。

在实验过程中，研究人员严格遵守伦理规范，确保实验动物的福利。所有实验均在东北农业大学实验室动物管理规定下进行，以减少实验对动物的伤害。在实验前，幼鱼被给予MS-222麻醉剂，以减轻其在实验过程中的不适。这种伦理考量不仅体现了对动物的尊重，也为实验的科学性和可重复性提供了保障。

本研究的成果不仅为IHN的防控提供了新的解决方案，也为疫苗研发提供了理论依据。通过基因工程手段调整病毒的关键蛋白，可以实现对病毒致病性的有效控制，同时增强疫苗的安全性和有效性。这种策略不仅适用于IHNV，也可能适用于其他副粘病毒的防控。此外，研究还揭示了糖蛋白在病毒致病性中的重要作用，为未来的病毒研究和疫苗开发提供了新的方向。

总体而言，本研究在病毒学和免疫学领域取得了重要进展。通过构建减毒的IHNV疫苗，研究人员不仅验证了该疫苗的有效性，还深入探讨了其作用机制。这些发现对于保障虹鳟鱼养殖业的健康发展，减少疾病带来的经济损失，具有重要的现实意义。同时，该研究也为疫苗开发提供了新的思路，即通过基因工程手段调整病毒的关键蛋白，使其既能诱导免疫反应，又不会对宿主造成严重伤害。这种策略的应用，将为未来疫苗的研发和推广奠定坚实的基础。