将Claudin-3鉴定为大鼠丙型肝炎病毒的进入因子

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Identification of claudin-3 as an entry factor for rat hepacivirus

该研究通过建立可支持NRHV1全生命周期的鼠源细胞系，揭示了NRHV1通过CLDN3进入细胞的机制，发现Ile44和Trp46是关键氨基酸残基，且CLDN3在宿主特异性中起决定作用。研究还比较了HCV与NRHV1的进入因子异同，为HCV疫苗研发提供了新模型。

　　### 病毒学研究中的关键发现：揭示NRHV1的感染机制与潜在疫苗开发

肝炎C病毒（HCV）是导致慢性肝病的主要病原体之一，其感染在全球范围内造成了巨大的公共卫生负担。据估计，全球约有5800万人感染HCV，每年新增病例约150万例。尽管近年来直接作用抗病毒药物（DAAs）的出现显著提高了HCV的治愈率，但全球范围内消除HCV仍然面临挑战，这主要归因于这些药物的高昂成本以及缺乏有效的疫苗。因此，开发适合研究HCV感染机制的小鼠模型成为推动疫苗研发和深入理解病毒病原学的重要途径。

在这一背景下，挪威鼠肝炎病毒1（NRHV1）作为一种与HCV相关的非人肝炎病毒，被认为是一个有前景的替代模型。然而，由于缺乏有效的细胞培养系统，NRHV1的病毒学特性，如细胞进入机制，仍未被充分阐明。为了克服这一障碍，研究团队通过建立可感染或不可感染NRHV1的细胞系，揭示了该病毒依赖于特定的宿主因子进行细胞进入，并进一步明确了这些宿主因子在病毒传播中的作用。

#### NRHV1的复制能力与抗病毒药物作用

研究首先评估了多种啮齿类肝癌细胞系对NRHV1复制的支持能力。结果显示，NRHV1的子基因组复制子（SGR）RNA在大鼠McA-RH7777细胞和小鼠Hepa1-6细胞中表现出较强的复制能力，而AML12细胞则无法支持NRHV1的复制。这一结果表明，AML12细胞可能由于缺乏肝细胞特异性微小RNA-122（miR-122）而不具备感染NRHV1的能力。为了验证这一点，研究团队通过将miR-122导入AML12细胞，使其具备支持NRHV1复制的能力，进一步支持了miR-122在病毒复制中的关键作用。

此外，研究还评估了多种抗病毒药物对NRHV1复制的影响。结果显示，第二代NS5A抑制剂Pibrentasvir（PIB）能够以剂量依赖性方式抑制病毒复制，而NS5B抑制剂Sofosbuvir（SOF）在10 μM浓度下效果不显著。值得注意的是，第一代NS5A抑制剂Daclatasvir（DCV）在10 μM浓度下也表现出一定的抑制效果。通过组合治疗，即同时使用DCV和PIB，病毒复制被显著抑制，其中在1.8 μM和3.2 μM的浓度下分别达到约50%和90%的抑制效果。这些发现为后续建立清除病毒的细胞系提供了重要依据。

#### NRHV1的感染机制与宿主因子的识别

为了进一步明确NRHV1的感染机制，研究团队构建了可感染的细胞系，并分析了其与HCV进入因子的相似性。结果显示，NRHV1感染需要多个宿主因子的协同作用，包括SR-BI、CD81和OCLN，但不依赖于CLDN1。这一发现与HCV的进入机制相似，但在某些细节上存在差异，例如，NRHV1更倾向于利用CLDN3作为进入因子，而非CLDN1。通过基因沉默实验，研究团队发现当这些因子被抑制时，NRHV1的进入和复制均受到显著影响，这进一步支持了它们在病毒生命周期中的关键作用。

#### CLDN3作为NRHV1的关键进入因子

研究进一步聚焦于CLDN3在NRHV1进入中的作用。通过构建不同物种的CLDN3表达系统，发现只有小鼠和大鼠的CLDN3能够支持NRHV1的感染，而人类CLDN3则不具备这一功能。这一结果提示CLDN3可能在啮齿类动物中具有特定的结构或功能特性，使其能够作为NRHV1的进入因子。进一步的结构分析和突变实验表明，CLDN3的第1个细胞外环（EL1）中的两个关键氨基酸残基——Ile44和Trp46——对NRHV1的进入至关重要。当这两个残基被替换后，病毒的进入能力显著下降，这表明它们在病毒与宿主细胞的相互作用中扮演着重要角色。

#### 进一步的实验验证与机制探讨

为了验证这些发现，研究团队利用了荧光报告系统，通过观察病毒进入后是否触发特定的信号通路来评估感染情况。结果显示，当NRHV1感染细胞后，其NS3/4A蛋白能够切割鼠源性线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS），从而引发细胞内的信号反应。此外，通过构建不同CLDN3的突变体并进行感染实验，发现只有特定的残基替换能够影响病毒的进入能力。例如，将Ile44替换为Asn的突变体能够恢复病毒的进入，而将Trp46替换为Ala的突变体则显著抑制病毒的进入。这些结果不仅揭示了CLDN3在病毒进入中的关键作用，还提供了关于其结构功能的线索。

#### 结论与展望

综上所述，研究团队成功建立了支持NRHV1完整生命周期的细胞模型，包括大鼠来源的McA1.8细胞和小鼠来源的AML/122/rCLDN3细胞。这些细胞模型为研究NRHV1的感染机制、疫苗开发及抗病毒药物筛选提供了重要的工具。此外，研究还揭示了CLDN3在NRHV1进入中的关键作用，以及其特定的氨基酸残基在宿主范围适应中的重要性。这些发现不仅有助于理解非人肝炎病毒的感染机制，也为HCV的研究提供了新的视角，特别是关于病毒与宿主细胞的相互作用以及病毒适应性进化的机制。

未来的研究可以进一步探讨CLDN3与其他宿主因子的相互作用，以及病毒在不同宿主中的传播特性。此外，利用这些细胞模型，科学家可以更深入地研究病毒的复制、组装和释放过程，为开发更有效的抗病毒策略提供理论支持和实验依据。通过这些努力，有望在非人类肝炎病毒的研究基础上，推动HCV疫苗和治疗手段的创新，最终实现对全球肝炎病毒感染的全面控制。