经乳酸化修饰增强的m5C RNA改变了脉络膜新生血管的形成过程

《Research》：Lactylation-Boosted m5C RNA Modification Drives Choroidal Neovascularization

m?C甲基化通过NSUN2介导的AKAP2-PKA-VEGFR2通路促进脉络膜新生血管化形成，其中乳酸脱氢酶A（LDHA）驱动的组蛋白H3K18la修饰增强NSUN2表达，进而稳定AKAP2 mRNA并激活血管生成信号。

　　在生命科学研究中，RNA的后转录修饰（posttranscriptional RNA modification）是调控基因表达和细胞功能的重要机制之一。其中，N5-甲基胞嘧啶（m⁵C）作为一种广泛存在于多种RNA分子中的修饰形式，不仅在细胞结构调控、稳定性维持以及翻译效率提升方面发挥着关键作用，还在多种疾病的发生发展中扮演着重要角色。例如，在肿瘤发生、免疫调节以及眼部疾病如视网膜血管异常增生（choroidal neovascularization, CNV）中，m⁵C的修饰水平与病理过程密切相关。然而，关于m⁵C及其关键甲基转移酶NSUN2在CNV中的具体作用机制，目前仍存在许多未解之谜。本文通过系统性的研究，揭示了NSUN2介导的m⁵C修饰在CNV病理过程中的关键作用，并进一步探讨了其调控机制，为相关疾病的治疗提供了新的思路。

### m⁵C与NSUN2在病理血管内皮细胞中的表达上调

研究团队首先比较了携带CNV的小鼠与对照组在视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜复合物中m⁵C修饰水平的差异，以探究其对CNV发生发展的潜在影响。结果表明，在CNV模型中，脉络膜内皮细胞（CECs）中的m⁵C修饰水平显著升高。此外，在缺氧环境下，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中m⁵C的表达也明显增强，这提示m⁵C修饰可能与缺氧环境下的血管生成密切相关。通过单细胞分析，研究者还发现CNV相关的内皮细胞群体中，NSUN2的表达显著上调，进一步支持了m⁵C修饰在CNV中的核心地位。NSUN2作为一种m⁵C甲基转移酶，其表达的增加与m⁵C水平的升高形成正向反馈，可能在内皮细胞的异常增殖和迁移中发挥关键作用。

### NSUN2促进内皮细胞的异常增殖与血管生成

为了验证NSUN2在CNV中的功能，研究者利用短发夹RNA（shRNA）技术对HUVECs和原代CECs中的NSUN2进行了敲低。实验结果显示，NSUN2的表达下调显著抑制了内皮细胞的增殖、迁移和管状结构形成能力。进一步的体外实验表明，NSUN2的缺失导致内皮细胞的迁移能力下降，而体内实验则通过鸡胚绒毛膜（CAM）模型验证了NSUN2对血管生成的促进作用。研究发现，NSUN2的沉默显著降低了CAM模型中新生血管的形成，表明其在血管生成中的重要性。此外，定量PCR和Western blot分析显示，NSUN2的缺失显著降低了多个关键促血管生成基因（如ITGAV、ITGB3、FGF2和ANGPT2）的表达水平，这些基因在内皮细胞的新生血管形成和血管稳定性中具有重要作用。这一发现表明，NSUN2通过调控这些基因的表达，可能在CNV的形成过程中起到关键的推动作用。

### NSUN2在CNV模型中的病理作用

为了进一步探讨NSUN2在CNV中的作用，研究者构建了EC特异性NSUN2缺失的小鼠模型，并在激光诱导的CNV模型中评估其影响。结果显示，与对照组相比，NSUN2缺失的小鼠在激光诱导后表现出显著减少的视网膜血管渗漏现象。这表明NSUN2在维持CNV相关血管异常中具有不可或缺的作用。此外，NSUN2缺失的小鼠CNV病变面积减少了约69.4%，进一步验证了NSUN2在CNV进展中的关键地位。通过免疫荧光染色，研究者确认了NSUN2蛋白在内皮细胞中的表达缺失，这为NSUN2在CNV中的作用提供了直接的证据。这些数据不仅揭示了NSUN2在CNV中的病理功能，也为相关疾病的治疗策略提供了新的方向。

### AKAP2作为NSUN2介导的潜在靶点

在揭示NSUN2促进CNV的机制方面，研究者通过多组学分析（包括转录组、蛋白质组和m⁵C免疫沉淀测序）识别出AKAP2作为NSUN2的重要靶点。AKAP2是一种支架蛋白，能够将蛋白激酶A（PKA）定位于特定的亚细胞区域，从而调节内皮细胞的迁移和管状结构形成。研究发现，NSUN2的缺失导致AKAP2的表达水平显著下降，同时其m⁵C修饰水平也相应降低。通过进一步的实验，研究者证实NSUN2通过增加AKAP2的m⁵C修饰水平，从而增强了AKAP2 mRNA的稳定性，并最终促进了VEGFR2的表达。VEGFR2是血管生成过程中至关重要的受体，其表达的上调有助于内皮细胞的增殖和血管形成。因此，NSUN2通过调控AKAP2的表达，间接促进了VEGFR2的表达，从而推动了CNV的发展。

### ALYREF作为AKAP2的m⁵C识别蛋白

为了深入理解NSUN2如何调控AKAP2的表达，研究者进一步探讨了m⁵C修饰的识别机制。通过RNA免疫沉淀（RIP）和染色质免疫沉淀（ChIP）实验，研究者发现ALYREF是AKAP2 mRNA上m⁵C修饰的特异性识别蛋白。ALYREF能够通过结合m⁵C修饰的AKAP2 mRNA，从而稳定其表达水平，促进其在细胞内的积累。研究者还通过ALYREF的敲低实验，发现其表达的减少显著降低了AKAP2的表达和稳定性，进一步支持了ALYREF在AKAP2调控中的作用。此外，NSUN2的缺失导致ALYREF对AKAP2的结合能力下降，这表明NSUN2通过促进AKAP2的m⁵C修饰，进而通过ALYREF的识别作用，增强了AKAP2的稳定性。这一发现揭示了m⁵C修饰与RNA稳定性之间的紧密联系，并为理解NSUN2如何通过AKAP2调控血管生成提供了新的视角。

### 历史乳酸化与NSUN2表达的调控

研究还发现，NSUN2的表达受到一种名为H3K18la的组蛋白乳酸化修饰的调控。H3K18la是乳酸与组蛋白结合后形成的一种化学修饰，其在内皮细胞中具有显著的表达增强。通过CUT&Tag和ChIP-qPCR实验，研究者证实H3K18la在NSUN2启动子区域的富集，表明其可能通过改变染色质结构，促进NSUN2的转录。进一步的实验显示，乳酸的补充显著增强了NSUN2和AKAP2的表达，而糖酵解抑制剂则导致其表达水平下降，这表明乳酸代谢与NSUN2的表达之间存在直接联系。此外，研究者还发现LDHA（乳酸脱氢酶A）在NSUN2表达调控中起关键作用，而LDHB则表现出较弱的调控效果。这一发现为理解乳酸代谢如何影响NSUN2的表达提供了新的依据。

### 代谢微环境与RNA修饰的协同作用

研究还指出，代谢微环境的变化对RNA修饰具有深远影响。在缺氧环境下，内皮细胞的代谢模式发生改变，乳酸的积累可能通过组蛋白乳酸化修饰促进NSUN2的表达，进而影响m⁵C修饰水平和相关基因的表达。这一过程形成了一个从代谢微环境到RNA修饰再到病理血管生成的信号传导链。具体而言，乳酸通过促进H3K18la的形成，激活NSUN2的转录，进而增加m⁵C修饰水平，最终通过AKAP2的稳定性增强和VEGFR2的表达上调，推动CNV的发生和发展。这种多层级调控机制不仅揭示了RNA修饰在血管生成中的作用，也为理解代谢与基因表达之间的复杂关系提供了新的视角。

### 研究意义与未来展望

本文的研究成果揭示了NSUN2介导的m⁵C修饰在CNV病理过程中的关键作用。NSUN2的表达调控与组蛋白乳酸化修饰密切相关，而AKAP2作为NSUN2的下游靶点，通过其m⁵C修饰的稳定性增强，进一步促进了VEGFR2的表达，从而推动了内皮细胞的异常增殖和血管生成。这些发现不仅有助于深入理解CNV的分子机制，还为相关疾病的治疗提供了新的思路。例如，针对NSUN2或其上游调控因子（如LDHA或H3K18la）的干预策略，可能成为抑制CNV进展的有效手段。

此外，研究还指出，AKAP2在某些AMD患者中可能与抗VEGF治疗的疗效相关。在这些患者中，AKAP2的表达可能因m⁵C修饰的异常而受到影响，从而导致对现有治疗方案的耐药性或疗效不佳。因此，未来的研究可以进一步探索NSUN2介导的AKAP2调控是否与抗VEGF治疗的失败相关，并开发针对这一通路的新治疗策略。

综上所述，本文的研究为理解CNV的分子机制提供了新的视角，揭示了组蛋白乳酸化、NSUN2介导的m⁵C修饰以及AKAP2在CNV中的协同作用。这些发现不仅有助于揭示代谢微环境与RNA修饰之间的复杂关系，还为开发新的治疗策略提供了理论依据。未来的研究可以进一步探索这一调控通路在其他血管相关疾病中的作用，并尝试通过靶向NSUN2或其相关调控因子，为CNV及其他血管异常疾病提供更有效的治疗方案。