HDAC抑制剂（SAHA）能够增强B7-H3特异性CAR T细胞对软骨肉瘤细胞的细胞毒性作用，并在原位小鼠模型中延长生存期

《Translational Oncology》：HDAC inhibitor (SAHA) enhances B7-H3-specific CAR T cell cytotoxic efficacy against chondrosarcoma cells and prolongs survival in an orthotopic mouse model

软骨肉瘤B7-H3 CAR-T细胞联合SAHA治疗有效抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期。体外实验显示SAHA（0.5μM）处理肿瘤细胞5天可显著增强B7-H3表达（MFI从2.1×10^5增至3.3×10^5，p<0.05），使CAR-T细胞杀伤效率提升至98.1%（p<0.001）。体内实验中，B7-H3 CAR-T联合SAHA组100%存活超过400天，肿瘤体积抑制率达91.3%，显著优于单独CAR-T组（p<0.01）和对照组（p<0.001）。机制研究显示SAHA通过调控NPT2通路增强B7-H3表达，同时抑制FasL介导的T细胞凋亡。研究证实靶向免疫检查点B7-H3并与HDAC抑制剂联用可突破实体瘤CAR-T治疗瓶颈。

　　高分化软骨肉瘤（Grades II、III和去分化型）是一种侵袭性强的原发性恶性骨肿瘤，其特征是含有透明软骨样肿瘤组织，但目前尚无有效的全身性治疗方法。对于局部病变，通常采用完全手术切除并确保切缘为阴性，以达到最佳治疗效果。然而，高分化软骨肉瘤往往会发生系统性扩散，导致整体生存率仅为29%。这些临床发现凸显了开发更有效的全身性治疗手段的迫切需求。其中，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法被认为是一种有潜力的治疗方式。在本研究中，研究人员针对高分化软骨肉瘤细胞中高度表达但正常组织中表达受限的肿瘤相关抗原B7-H3，设计了特异性靶向B7-H3的CAR T细胞。研究结果显示，这些CAR T细胞在体外能够有效杀伤软骨肉瘤细胞，并在免疫缺陷小鼠模型中显著抑制肿瘤生长，延长肿瘤携带小鼠的生存时间。

为了进一步提升B7-H3 CAR T细胞的抗肿瘤活性，研究团队对肿瘤细胞或CAR T细胞进行了体外低剂量伏立诺他（SAHA）处理。SAHA是一种组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，已被证明能够上调多种实体癌细胞中B7-H3的转录和表达，同时也能够增强CAR的表达。研究结果表明，对B7-H3 CAR T细胞或软骨肉瘤细胞进行SAHA处理，能够显著提高CAR T细胞在体外和体内的抗肿瘤细胞毒性作用。

在实验方法部分，研究人员首先构建了含有B7-H3基因的质粒，并利用逆转录病毒载体SFG进行转染。通过PCR技术，从Panc-1细胞系中扩增了全长度的人源2Ig-B7-H3和4Ig-B7-H3基因，并将其克隆至逆转录病毒载体中。同时，还从InVivogene公司获得小鼠B7-H3基因，同样进行克隆处理。随后，将重链和轻链的可变区从376.96小鼠杂交瘤中克隆，并作为单链可变片段（scFv）插入到经过验证的CAR结构中，包括人源CD8a铰链和跨膜结构域、CD28或4–1BB等共刺激结构域以及CD3ζ信号传导结构域。最终，B7-H3.CAR基因 cassette被克隆至逆转录病毒载体SFG中，用于后续CAR T细胞的生成。

CAR T细胞的生成过程涉及从健康供体的外周血单核细胞（PBMCs）中分离T细胞，并通过特定的细胞因子进行激活和扩增。在第0天，PBMCs被激活并置于预涂有CD3和CD28抗体的细胞培养板中。第1天，激活的T细胞在添加IL-7和IL-15的培养基中进一步扩增。第2天，激活的T细胞被转移到含有B7-H3或CD19 CAR结构的逆转录病毒颗粒的培养板中。经过48小时的培养后，转染的T细胞被转移到新的培养板中，继续扩增至第8天。在此期间，研究人员对转染效率进行了检测，并对不同处理条件下的CAR T细胞进行了比较分析。最终，CAR T细胞被收集并用于后续的体外和体内实验。

在CAR T细胞介导的细胞毒性实验中，研究人员评估了SAHA处理对软骨肉瘤细胞B7-H3表达的影响。通过将CS-1和SW1353细胞分别用0.5 μM SAHA处理5天后，观察到B7-H3的表达水平显著增加。此外，研究还发现SAHA处理能够增强B7-H3 CAR T细胞对软骨肉瘤细胞的细胞毒性作用。在体外实验中，SW1353细胞在与B7-H3 CAR T细胞共培养后，存活率从20.3%降低至0.9%，而使用非转导T细胞（NT T cells）进行处理的细胞则没有显著变化。这一结果表明，SAHA处理能够显著提升B7-H3 CAR T细胞的抗肿瘤活性。

进一步的实验表明，SAHA处理的软骨肉瘤细胞在与B7-H3 CAR T细胞共培养时，能够显著增加IFN-γ的释放。IFN-γ是一种重要的细胞因子，能够增强T细胞的活性并促进抗肿瘤免疫反应。研究发现，SW1353和CS-1细胞在与B7-H3 CAR T细胞共培养后，IFN-γ水平分别从1094.4 pg/ml增加至1160.5 pg/ml，显示出显著的提升。而在使用非转导T细胞的情况下，IFN-γ水平没有明显变化，说明SAHA处理增强了CAR T细胞对B7-H3抗原的识别和反应能力。

在体内实验中，研究人员利用免疫缺陷小鼠模型（NSG小鼠）评估了B7-H3 CAR T细胞与SAHA联合治疗的效果。NSG小鼠被注射SW1353软骨肉瘤细胞后，分为五个处理组，分别接受不同的治疗方案。结果显示，接受B7-H3 CAR T细胞和SAHA联合治疗的小鼠表现出显著的生存延长，肿瘤体积明显减小。相比之下，仅接受CD19 CAR T细胞或SAHA处理的小鼠肿瘤体积持续增大，生存时间较短。此外，接受体外SAHA处理的B7-H3 CAR T细胞治疗的小鼠中，有60%在400天的监测期内死亡，而仅接受B7-H3 CAR T细胞治疗的小鼠生存时间更长，但最终仍然无法避免肿瘤的生长。

研究还发现，SAHA处理不仅能够增加B7-H3的表达，还能够通过影响多个信号通路，包括增强蛋白运输机制和抑制T细胞在肿瘤微环境中的凋亡，从而提升CAR T细胞的抗肿瘤效果。在肿瘤早期，效应性CD8+ T细胞能够分泌多种细胞因子，直接杀伤肿瘤细胞。然而，随着肿瘤的发展，肿瘤细胞会逐渐形成免疫逃逸机制，如受体下调、肿瘤内部异质性增加以及肿瘤微环境的免疫抑制作用，导致T细胞活性下降和凋亡增加。SAHA通过下调FasL（CD95L）的表达，减少T细胞的凋亡，从而增强抗肿瘤免疫反应。

尽管本研究展示了B7-H3 CAR T细胞与SAHA联合治疗在软骨肉瘤模型中的有效性，但仍存在一些局限性。首先，研究使用的是异种移植小鼠模型，这种模型可能会高估CAR T细胞和放疗的效果，因此需要进一步探索自体或同源模型以验证这些结果。其次，研究中使用的SAHA处理剂量和时间可能需要优化，以达到最佳的治疗效果。此外，SAHA处理对CAR T细胞的长期影响以及其在人体中的安全性也需要进一步研究。

总的来说，本研究为高分化软骨肉瘤的治疗提供了一种新的策略，即通过SAHA处理增强B7-H3 CAR T细胞的抗肿瘤活性。这一方法在体外和体内实验中均显示出显著的疗效，尤其是在延长小鼠生存时间和抑制肿瘤生长方面。然而，为了将这些成果转化为临床应用，还需要进一步研究其在人体中的安全性和有效性，以及优化治疗方案以提高整体疗效。未来的研究可能会关注如何结合其他免疫调节手段，以克服CAR T细胞在实体肿瘤中的局限性，并探索更广泛的适用范围。