《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A novel fluorescent probe for in vivo H?S monitoring in inflammatory arthritis
王一涵|高一芳辉|周嘉琪|江媛|王月|张成|孟庆涛|张志强
辽宁科技大学化学工程学院，中国辽宁省鞍山市114051
摘要
硫化氢（H?S）是一种重要的气体信号分子，在多种生理和病理过程中发挥着关键的调节作用。在本研究中，我们基于尼罗红荧光团成功开发了一种新型的H?S荧光探针NR。该探针通过异硫氰酸酯功能团特异性识别H?S，其识别机制通过高分辨率质谱法得到了验证。NR探针具有优异的稳定性和高灵敏度，检测限为3.66 μM。由于低细胞毒性和适用于生理pH条件，NR探针已成功应用于体内H?S的实时监测。在裸鼠LPS诱导的关节炎模型中，NR探针能够有效监测炎症部位的H?S水平变化。这种探针的成功开发为研究炎症性疾病中H?S的病理生理机制提供了有力工具，展现出在疾病诊断和治疗监测方面的巨大潜力
引言
硫化氢（H?S）是一种内源性信号分子，具有独特的化学性质，其生物学功能远超传统上作为有毒物质的认知。[[1], [2], [3]除了信号传导功能外，H?S还通过多种机制维持重要的生理稳态：抗氧化保护[4]、神经调节[5]、抗炎作用[6]、激素调节[7]以及通过血管扩张实现的心血管控制[8]等。值得注意的是，H?S在多种病理生理过程中具有双重调节作用：在生理浓度下它具有细胞保护作用，而过高水平则与多种病理状况密切相关。大量研究表明，H?S信号通路的失调与多种重大疾病的发病机制和进展密切相关，包括心血管疾病[[9], [10], [11]、神经退行性疾病[[12], [13], [14], [15]和代谢综合征[[16], [17], [18]，这使其成为有前景的治疗和诊断靶点。因此，迫切需要开发一种简单、快速且可靠的H?S检测方法。
荧光探针因其高灵敏度、优异的选择性和实时成像能力而在H?S检测中展现出显著价值[[19], [20], [21], [22]。这些荧光探针基于H?S的亲核性和还原性设计，利用特定的识别机制，如叠氮化物还原[[23], [24], [25]、亲核加成[[26], [27], [28]和亲核取代[[29], [30], [31], [32]。这些反应通过明确的光物理过程触发荧光激活，从而在生物系统中实现选择性和敏感的H?S检测。目前，基于香豆素[33,34]、萘酰亚胺[35,36]和罗丹明[37,38]等荧光团的H?S荧光探针已被广泛研究。然而，由于发射波长（< 600 nm）容易被组织自荧光掩盖，且难以区分H?S与半胱氨酸和其他含硫物质，这些探针在实际生物体成像中的应用仍面临挑战。因此，开发具有适合体内检测特性的新型H?S荧光探针已成为生物医学成像领域的紧迫任务。
本文报道了一种基于尼罗红的turn-on荧光探针NR，其将异硫氰酸酯功能团作为H?S响应识别位点。NR探针能够高度选择性地检测H?S，可区分半胱氨酸，检测限为3.66 μM。值得注意的是，NR探针在650 nm处具有近红外发射特性，适用于深层组织成像，并具有出色的生物相容性。我们成功将该探针应用于体外和体内的外源性H?S实时监测。此外，还在LPS诱导的小鼠关节炎模型中实现了H?S的实时成像。NR探针相比以往的探针具有显著优势（见表S1.），包括高特异性和红移的发射波长，这一点在关节炎模型中得到了验证。该探针的开发为研究H?S相关的病理生理过程及探索炎症性疾病中的H?S病理机制提供了有价值的工具，凸显了其在诊断和治疗应用中的巨大潜力。
试剂和仪器
3-二乙氨基酚、1,6-二羟基萘、5-(二乙氨基)-2-硝基酚、对甲苯基异硫氰酸酯、N-溴代琥珀酰亚胺和过氧化苯甲酰购自Macklin Biochemical Technology Co., Ltd。N-二甲甲酰胺、四氯化碳、丙酮、甲醇、二氯甲烷、浓盐酸以及所有阴离子的钠盐均来自Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd。所有试剂和溶剂均为分析级。去离子水来自Merck
探针NR对H?S的光谱响应
图2A显示了在PBS缓冲液中逐渐加入H?S时NR的UV–Vis吸收光谱。结果表明，在H?S（0–120 μM）存在下，NR探针的吸收峰从535 nm红移至590 nm，同时吸光强度从0.15增加到0.24，颜色从浅粉色变为肉眼可辨的紫色。图2B展示了NR探针的选择性测试结果。
结论
总之，成功设计并合成了一种基于尼罗红的新型荧光探针NR，用于高特异性检测H?S。光谱和生物学评估证实NR探针在生理pH条件下具有优异的稳定性、高灵敏度和出色的生物相容性。高分辨率质谱法明确证实了NR探针与H?S之间的反应机制。该探针已成功应用于体内荧光成像，实现了敏感的H?S检测
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了“辽宁省科学技术厅项目（2024LNYKJ27”和“辽宁省教育厅项目（JYTQN2023246）”的支持。
