过亚硝酸盐响应型二氰异佛尔酮-黄蒽近红外荧光探针，用于监测和治疗糖尿病性肝损伤

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Peroxynitrite-responsive dicyanoisophorone-xanthene NIR fluorescent probe for monitoring and therapeutic evaluation of diabetic liver injury

糖尿病肝损伤（DLI）早期诊断面临技术挑战，本研究开发新型近红外荧光探针DCIP-ONOO，通过检测一氧化氮自由基（ONOO-）实现DLI实时成像与疗效监测，灵敏度达119.6 nmol/L，并在糖尿病小鼠模型中验证其安全性及有效性。

　　

费孔|明阳|陶阳|秦静灿

上海中医药大学第七人民医院实验动物服务中心，中国上海市大同路358号，200137

摘要

糖尿病引起的慢性高血糖可导致肝损伤（DLI），若不及时干预，可能会发展成不可逆的后果。因此，开发一种简单且快速的DLI早期精准诊断方法具有重要意义。在本研究中，我们基于二氰异佛尔酮-黄酮骨架，设计了一种可激活的近红外（NIR）荧光探针（DCIP-ONOO），用于通过过氧亚硝酸盐（ONOO-）成像来监测和治疗DLI。添加ONOO-后，DCIP-ONOO在770 nm处的荧光强度增强了27.6倍，具有优异的选择性、快速响应性和低检测限（119.6 nmol/L）。体外成像实验证实该探针能够敏感地检测ONOO-。更重要的是，在糖尿病小鼠模型中，DCIP-ONOO成功实现了DLI的体内成像，并监测到了二甲双胍对症状的缓解作用，且未造成任何器官损伤。这些结果表明DCIP-ONOO是有效追踪糖尿病肝毒性过程中ONOO-的潜在工具。

引言

糖尿病是一种由多种因素引起的复杂代谢紊乱，包括遗传倾向和内分泌功能障碍。它已成为全球性的流行病，对人类健康和全球经济构成威胁[1]。值得注意的是，糖尿病中的慢性高血糖会引发严重的并发症，特别是肝损伤（DLI），若不及时干预，可能会发展成不可逆的后果[2,3]。目前DLI的诊断方法主要依赖于生化检测和组织学分析，但这些方法无法实时和原位显示糖尿病并发症过程中细胞或器官的损伤[4,5]。因此，开发一种简单快速的DLI早期精准诊断方法具有重要意义。

在DLI的发病机制中，高血糖会诱导线粒体氧化应激和内质网应激，从而产生过多的活性氧/氮物种（ROS/RNS）[6,7]。作为最具代表性的活性氮物种之一，过氧亚硝酸盐（ONOO-）在肝脏疾病的发展中起着关键作用。它通过一氧化氮（NO）和超氧阴离子（O?·-）之间的生化反应内源性生成。ONOO-具有强氧化性和亲核性，能够与多种生物活性分子（包括核酸、酶和蛋白质）发生反应，导致肝脏氧化应激，进而直接损伤肝细胞，加速肝脏疾病的发病和进展[8],[9],[10]。此外，ONOO-还能通过激活NLRP3炎性体来促进细胞因子（如TNFα、IL-1β、IL-6等）的释放，同时抑制由AMPK/mTOR轴介导的抗炎信号通路[11],[12],[13]。综上所述，ONOO-通过氧化损伤、炎症放大和代谢失调在DLI中发挥多方面的作用。因此，动态监测ONOO-对于直接评估DLI的病理严重程度至关重要。

小分子荧光探针因其优异的灵敏度、操作简便性和与体内成像的兼容性，已成为实时检测ONOO-的理想平台。最近的研究进展使得利用芳香硼酸酯[4],[14],[15],[16]、肼[17],[18],[19]和其他功能基团[21]等识别基团开发出多种ONOO-响应探针成为可能。然而，大多数荧光探针的发射波长不佳，不适合体内检测ONOO-。二氰异佛尔酮衍生的骨架因其出色的光物理性质（如较大的斯托克斯位移、结构简单、光稳定性强、高荧光量子产率和环境敏感性）而被广泛用于荧光探针的开发。这些骨架通常作为探针设计的基础框架，通过分子结构调整实现对多种分析物的靶向检测。基于我们之前开发的基于二氰异佛尔酮的NIR荧光探针PDNP（可在体外和体内精准检测ONOO-[22]），我们进一步设计并合成了另一种新型探针，专门优化用于DLI中ONOO-的检测。结果表明，该探针对ONOO-具有优异的稳定性和选择性，在0–12 μM浓度范围内显示出强烈的线性相关性。此外，它还成功用于小鼠DLI模型中ONOO-动态的实时成像。这一进展为早期检测和治疗干预提供了新策略，有望改善肝病管理的临床效果。

材料与方法

DCIP-ONOO的试剂、仪器和合成步骤的详细信息见支持信息（SI）。

细胞毒性和细胞成像

为了评估细胞毒性，将HepG2细胞接种在96孔板中并培养24小时。用PBS冲洗后，细胞暴露于含有不同浓度探针的培养基中24小时。未接受DCIP-ONOO处理的细胞作为对照组。通过CCK-8检测法量化细胞活力。

对于细胞成像，使用HepG2细胞（每孔1×10^5个细胞）

探针的合成

探针DCIP-ONOO是通过二氰异佛尔酮-黄酮（DCIP-OH）与二苯基膦酰氯反应合成的（方案1），并通过硅胶柱层析纯化。纯化产物通过1H NMR、13C NMR和高分辨率质谱（HR-MS）进行了全面表征，具体细节见SI。

探针DCIP-ONOO对ONOO-的光谱响应

研究了DCIP-ONOO在添加ONOO-前后的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱。如图1A所示，DCIP-ONOO在770 nm处显示出强烈的吸收

结论

总结来说，我们成功设计并合成了一种基于二氰异佛尔酮-黄酮骨架的可激活NIR荧光探针DCIP-ONOO。添加ONOO-后，DCIP-ONOO在770 nm处的荧光强度增强了27.6倍，具有优异的选择性、快速响应时间和低检测限。体外成像实验证实该探针能够敏感地检测ONOO-。更重要的是，在糖尿病小鼠模型中，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本工作部分得到了上海浦东新区卫生健康委员会科学研究计划（青年项目PW2025B-16）、上海浦东新区卫生健康委员会科学研究计划（联合研发项目PW2025D-06）、海军医学大学基础医学研究基金（2022MS023）的支持。