人类特异性逆转录转座子HERVK LTR5Hs通过调控ZNF729介导胚胎早期发育的新机制

本研究利用人类囊胚样干细胞模型，揭示了人特异性内源性逆转录病毒HERVK LTR5Hs在调控胚胎着床前发育中的关键作用。研究人员通过CRISPRi技术抑制LTR5Hs活性，发现其通过增强子功能调控锌指蛋白ZNF729的表达，进而影响细胞增殖和谱系分化。该研究为理解人类特异性发育调控机制提供了新视角。

　　

哺乳动物早期胚胎发育过程在物种间既存在保守性又表现出显著的差异性。尽管小鼠等模式生物的研究为理解哺乳动物发育提供了重要基础，但人类早期胚胎特有的发育特征和调控机制仍待深入探索。由于人类胚胎样本获取存在伦理和技术限制，科学家们迫切需要开发替代性研究模型。近年来，基于干细胞的3D胚胎模型——囊胚样体(blastoid)的出现，为研究人类特异性发育特征提供了前所未有的机会。

内源性逆转录病毒(ERVs)作为古代逆转录病毒感染生殖细胞后整合到基因组中的遗迹，约占人类基因组的8.9%。其中HERVK(HML-2)家族的LTR5Hs亚型在人类胚胎发育中表现出独特的活性模式：在八细胞期左右被转录激活，并在囊胚阶段保持活跃。LTR5Hs是人类进化中最年轻的内源性逆转录病毒，在人猿与旧世界猴分离后首次入侵基因组，并在人类与黑猩猩分离后仍保持活性。人类基因组中约700个LTR5Hs插入片段为人科动物所特有，其中一部分更是人类特异性插入。

尽管HERVK LTR5Hs在人类早期胚胎中的表达模式已被描述，但其在着床前发育中的功能影响仍不清楚。斯坦福大学医学院Joanna Wysocka团队在《Nature》发表的研究，通过遗传和表观遗传学方法操纵人类囊胚样体这一3D胚胎模型，揭示了HERVK LTR5Hs在人类特异性发育调控中的重要作用。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：利用CRISPR干扰(CRISPRi)系统特异性抑制LTR5Hs元件的活性；通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析囊胚样体的转录组特征；使用染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)研究ZNF729的基因组结合位点；建立基因敲除细胞系验证LTR5Hs元件的功能；采用粒子模板即时分区测序(PIP-seq)进行高通量单细胞转录组分析。实验使用的hnPSCs(人类naive多能干细胞)来源于外周血细胞，经过严格的伦理审查。

HERVK LTR5Hs影响囊胚样体形成

研究人员首先在人类囊胚样体模型中探究了HERVK LTR5Hs活性的表型效应。囊胚样体包含与囊胚谱系类似的细胞类型：产生胚胎本体的上胚层(epiblast)、形成胎盘的滋养外胚层(trophectoderm)以及发育成卵黄囊的下胚层(hypoblast)。通过使用CARGO-CRISPRi系统，研究团队实现了对LTR5Hs元件的高效选择性抑制。实验发现LTR5Hs表达水平与囊胚样体形成潜能之间存在相关性，高水平的LTR5Hs抑制会导致囊胚样体形成失败，产生类似暗球(dark spheres)的结构。

LTR5Hs抑制导致基因调控紊乱

高通量转录组分析显示，LTR5Hs抑制引起了广泛的基因表达变化。在高抑制克隆中，与胚胎形态发生和免疫反应等过程相关的基因类别出现显著失调。暗球结构缺乏空化现象，转录组分析显示其与正常囊胚样体存在明显分离，凋亡相关基因(如CASP7)表达上调。免疫染色证实暗球中cleaved CASP3阳性细胞数量显著增加，表明在高水平LTR5Hs抑制下，hnPSCs经历了与凋亡表型一致的广泛基因表达变化。

LTR5Hs抑制影响谱系特性

中等水平LTR5Hs抑制产生的囊胚样体表现出谱系缺陷。免疫染色显示，与对照组相比，中等抑制的囊胚样体中KLF17阳性和GATA4阳性细胞数量减少，SUSD2信号降低，表明上胚层和下胚层谱系存在缺陷。单细胞转录组分析发现了一个新的上胚层邻近簇(neo-epiblast)，该簇细胞主要来源于LTR5Hs-CARGO囊胚样体，表明neo-epiblast源于LTR5Hs抑制驱动的基因表达变化。

LTR5Hs元件作为上胚层增强子

研究人员通过基因编辑技术特异性删除了六个位于发育相关基因附近的LTR5Hs元件，发现每个缺失都导致候选靶基因的下调。LTR5Hs缺失对基因表达的影响具有序列依赖性、远距离激活能力和方向独立性等特点，这些都是增强子的典型特征。研究表明LTR5Hs元件作为人科动物特异性增强子，调控许多人类上胚层基因的表达。

人科动物转录组多样化

研究发现LTR5Hs对人类上胚层转录组的人科动物特异性多样化具有重要贡献。在144个LTR5Hs直接靶基因中，101个和82个基因分别在人类中表达而在小鼠或狨猴中不表达，表明LTR5Hs的顺式调控活性促进了上胚层转录组的物种特异性多样化。

人类特异性LTR5Hs插入的关键作用

研究揭示了一个人类特异性LTR5Hs插入对ZNF729基因的表达至关重要。ZNF729是一个KRAB锌指蛋白(KZFP)，含有37个锌指结构域，是人类蛋白质组中锌指数量最多的蛋白。该LTR5Hs插入仅在人类中存在，ZNF729基因也在进化上较为年轻，可能在旧世界类人猿(狭鼻猴)谱系中出现。在人类中，ZNF729表达强劲且与HERVK活性相关，而在黑猩猩中，尽管基因组中存在ZNF729，但在naive PSCs中表达较弱，猕猴中则未检测到表达。

ZNF729在hnPSCs中结合GC丰富序列

ZNF729通过其锌指结构域广泛结合GC丰富序列，几乎46%的结合峰与启动子区域重叠。在转座元件中，ZNF729主要结合年轻转座元件如SVA_D/F/B或LTR5Hs本身。Motif分析发现ZNF729倾向于结合富含G和C的序列，且ZNF729结合启动子的GC含量显著高于未结合启动子。研究表明ZNF729识别GC丰富序列，并在数千个启动子处招募TRIM28。

ZNF729调控基本细胞功能

ZNF729降解实验显示，其缺失主要引起基因下调而非上调。ZNF729调控的基因与细胞分裂、GTPase活性、RNA代谢过程等基本细胞过程相关。经典细胞周期调控因子如MYC、CDK1或CCND1都被ZNF729结合并激活，表明ZNF729可能是全局LTR5Hs抑制表型的主要驱动因子。

这项研究揭示了进化上年轻的基因如何通过捕获逆转录病毒来源的增强子而在人类谱系中获得表达，其产物随后通过结合和调控GC丰富启动子来影响基本细胞程序。研究发现HERVK LTR5Hs活性是囊胚样体形成所必需的，LTR5Hs抑制严重影响了囊胚样体上胚层的转录组，导致下胚层和极性滋养外胚层细胞数量减少。

研究证实了人类特异性LTR5Hs插入对ZNF729表达的重要性，ZNF729通过结合GC丰富启动子调控数百个关键基因，影响细胞增殖和囊胚样体形成潜能。值得注意的是，尽管ZNF729含有完整的KRAB结构域并能招募TRIM28，但在许多启动子处它充当转录激活因子而非抑制因子，这种机制可能涉及TRIM28介导的RNA聚合酶II(RNAPII)暂停释放或其他未知的TRIM28非依赖性机制。

这项工作不仅说明了最近出现的转座元件和基因如何在人类中赋予发育必需功能，还展示了基因调控网络的进化重塑不仅能导致物种特异性创新，还能创造新的依赖性，并赋予新出现的顺式调控元件和基因以必需性。研究为利用体外人类胚胎模型系统性地研究转座元件功能铺平了道路，为理解人类特异性发育特征提供了宝贵见解。