辣椒素激活的自噬作用在氧化应激条件下保护骨髓间充质干细胞（BMSC）的功能：机制及治疗意义

《Journal of Molecular Endocrinology》：Capsaicin-activated autophagy protects BMSC function under oxidative stress: mechanisms and therapeutic implications

骨髓间充质干细胞（BMSCs）在骨质疏松修复中起关键作用，但氧化应激会抑制其功能。本研究发现辣椒素（10 μM）通过激活TRPV1受体介导的Ca2?内流，抑制PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化，促进自噬（ATG5、P62、LC3B蛋白及mRNA上调），从而显著提高氧化应激下BMSCs的存活率（CCK-8）和骨分化能力（ALP/ARS染色及Runx2、OCN mRNA表达）。该机制为辣椒素治疗骨质疏松提供了新思路。

　　骨质疏松症是一种影响全球数百万人群的常见骨骼疾病，其特征是骨矿物质密度下降、骨骼结构退化以及骨折风险增加。这种疾病不仅影响患者的生活质量，还带来高昂的医疗成本。目前，临床治疗骨质疏松症的方法包括双膦酸盐和激素替代疗法等，但这些方法存在一定的局限性，如疗效有限、可能引发不良反应，如颌骨坏死和癌症风险增加等。因此，探索新的治疗方法和机制对于改善骨质疏松症的治疗效果具有重要意义。

在骨质疏松症的发展过程中，骨吸收与骨形成之间的平衡被破坏，导致骨量减少。骨髓间质干细胞（BMSCs）在骨再生和修复中发挥着关键作用，它们具有多向分化潜能，能够迁移到损伤部位，抑制局部免疫反应，并促进骨骼再生。然而，氧化应激是骨质疏松症中导致BMSCs功能受损的重要因素之一。氧化应激通常表现为活性氧（ROS）的过度生成和机体抗氧化防御机制之间的失衡，这种失衡会导致细胞膜、蛋白质和DNA的损伤，进而影响BMSCs的生存和分化能力。此外，ROS还会抑制BMSCs的成骨分化，并激活破骨细胞的活性，从而破坏骨骼的形成与吸收之间的平衡，加剧骨质疏松和骨折的风险。

在这一背景下，天然抗氧化剂如槲皮素、维生素E和 Leonurine 被发现能够通过清除ROS、保护BMSCs免受氧化损伤以及恢复骨代谢平衡，显示出治疗潜力。然而，关于辣椒素（Capsaicin）在调节BMSCs氧化应激反应和成骨分化中的作用及机制，仍需进一步研究。辣椒素是一种天然的生物碱，广泛存在于辣椒中，具有多种药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌和胃黏膜保护等作用。它主要通过激活瞬时受体电位香草酸受体1（TRPV1）来发挥其生物学功能，TRPV1是调控钙信号和多种细胞过程的关键受体。此外，辣椒素已被证明能够通过激活Ca2?/CaMKII/Nrf2通路，减轻骨关节炎等疾病的症状，并抑制M1型巨噬细胞的极化。

本研究旨在探讨辣椒素在氧化应激条件下对BMSCs功能的影响及其潜在机制。研究采用多种实验方法，包括细胞计数试剂盒（CCK-8）评估细胞活力，使用DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平，通过碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红S（ARS）染色分析成骨分化能力，利用Western blot和实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测相关蛋白和基因的表达水平。此外，通过免疫组织化学（IHC）分析TRPV1受体的表达情况，并利用Fluo-4探针检测细胞内钙离子动态变化，以探讨辣椒素对钙信号通路的影响。最后，研究还评估了PI3K/AKT/mTOR信号通路在辣椒素调控BMSCs成骨分化中的作用。

研究结果表明，辣椒素能够显著提高BMSCs在氢过氧化物（H?O?）刺激下的细胞活力，同时增强其抗氧化能力。通过检测细胞内ROS水平，发现辣椒素在不同浓度下能够剂量依赖性地减少ROS的积累，这说明其具有较强的抗氧化活性。此外，辣椒素还能够抑制由H?O?引起的细胞凋亡，表现为Bax mRNA表达减少和Bcl-2 mRNA表达增加。这些结果表明，辣椒素通过减少氧化应激，有助于保护BMSCs的活性。

进一步研究发现，辣椒素在H?O?处理的BMSCs中能够显著恢复其成骨分化能力。ALP和ARS染色结果显示，辣椒素处理的BMSCs在7天和21天后表现出更高的碱性磷酸酶活性和矿化结节形成能力，这表明其在促进成骨分化方面具有积极作用。同时，辣椒素能够显著上调成骨相关标志物的表达，包括ALP、RUNX2和SP7等蛋白和mRNA水平。这些结果表明，辣椒素不仅能够保护BMSCs免受氧化应激的伤害，还能够通过其抗氧化特性恢复BMSCs的成骨功能。

TRPV1受体在BMSCs中的表达被IHC分析证实，这提示TRPV1可能是辣椒素作用的一个潜在分子靶点。细胞内钙离子的动态变化被Fluo-4探针检测，结果显示H?O?处理显著抑制了BMSCs的钙离子内流，而辣椒素能够有效恢复这种内流，表明其在调节钙信号通路方面具有重要作用。此外，研究还发现辣椒素能够激活自噬，这通过Western blot和RT-PCR检测自噬相关蛋白（如ATG5、P62和LC3B-II）和mRNA（如Beclin1、P62和Lc3b）的表达水平得以验证。自噬是一种保守的溶酶体依赖性降解过程，能够清除受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和细胞毒性聚集体，从而维持细胞稳态。研究进一步发现，辣椒素诱导的自噬效应在使用PI3K激活剂740Y-P处理后被显著抑制，这表明PI3K/AKT/mTOR通路在辣椒素调控自噬中起关键作用。

PI3K/AKT/mTOR信号通路是细胞内重要的信号传导通路，参与多种细胞活动，包括细胞存活、自噬调控和氧化应激反应。研究发现，H?O?处理显著增加了PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平，而辣椒素能够有效抑制这些磷酸化事件，这表明其可能通过抑制该通路来促进自噬并保护BMSCs的成骨功能。此外，使用PI3K激活剂740Y-P处理后，辣椒素诱导的自噬效应被部分或完全逆转，进一步支持了PI3K/AKT/mTOR通路在辣椒素作用中的重要性。

研究还发现，辣椒素通过激活自噬，能够显著改善BMSCs在氧化应激条件下的成骨分化能力。这一作用在使用PI3K激活剂740Y-P处理后被抑制，表明该通路在辣椒素促进自噬和成骨分化中起关键作用。这些结果提示，辣椒素可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路并激活自噬，从而在氧化应激条件下保护BMSCs的成骨功能。

尽管本研究使用了雄性大鼠的BMSCs，但已有研究证据表明辣椒素的保护作用可能不受性别影响。因此，辣椒素可能对雌性BMSCs同样具有保护作用。此外，本研究提出了一种新的治疗骨质疏松症的策略，即通过激活内源性保护机制（如自噬）来实现长期稳定的调节。然而，研究中未对TRPV1受体的功能进行验证，例如通过TRPV1敲除或敲减模型，这使得我们无法完全确定TRPV1是否是辣椒素作用的必要分子靶点。因此，未来的研究应进一步探索TRPV1在辣椒素保护BMSCs功能中的具体作用，以促进该天然化合物在治疗骨质疏松症中的应用。

综上所述，本研究揭示了辣椒素在氧化应激条件下对BMSCs功能的保护作用，可能通过TRPV1介导的钙离子内流和PI3K/AKT/mTOR通路激活自噬的机制实现。这些发现不仅为骨质疏松症的治疗提供了新的思路，也为进一步研究辣椒素在骨骼修复和再生中的作用奠定了基础。