人类皮脂中游离脂肪酸双键位置的表征

《Journal of Chromatography Open》：Characterization of double bond position in free fatty acids of human sebum

本研究通过Paternò-Büchi反应结合LC-MS/MS技术，首次系统分析了人类皮脂中单不饱和脂肪酸（MUFAs）和多不饱和脂肪酸（PUFAs）的双键异构体，发现sapienic acid（C16:1n-10）占比达25%，验证了FADS2酶在皮脂合成中的主导作用，并揭示了男女间MUFAs含量无显著差异，而linoleic acid（C18:2n-6,9）存在性别差异。

　　脂肪酸（Fatty Acids, FAs）是构成皮肤表面脂质（Skin Surface Lipids, SSLs）的重要成分，而游离脂肪酸（Free Fatty Acids, FFAs）则在皮肤表面脂质中扮演着特殊角色。这些脂肪酸不仅参与皮肤屏障的形成，还在维持皮肤健康和防御功能方面发挥着关键作用。皮肤表面脂质由表皮和皮脂腺的脂质混合而成，其中皮脂成分在皮脂腺丰富的区域尤为丰富。研究发现，皮脂中的脂肪酸具有独特的结构特征，如碳链长度主要集中在C14到C18之间，末端存在分支，并且在Δ6位置通常具有一个双键。特别值得注意的是，超过三分之一的皮脂脂肪酸中包含一个双键，这表明其在脂肪酸合成过程中具有一定的复杂性。

在人体皮肤中，脂肪酸的异常合成可能与多种炎症性皮肤疾病有关，如寻常痤疮、玫瑰痤疮、银屑病和脂溢性皮炎。这些疾病的发生与皮脂成分的改变密切相关，因此，明确脂肪酸双键的位置及其异构体对于理解这些疾病的发生机制至关重要。然而，目前对于人体皮脂中不同异构体的系统性研究仍显不足。因此，研究团队旨在开发一种新的分析策略，以区分游离脂肪酸中双键的不同位置。他们结合了Paternò-Büchi反应和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，该方法首先在标准脂肪酸上进行优化，然后应用于人体皮脂样本。

Paternò-Büchi反应是一种光化学反应，通过将醛类化合物与烯烃发生[2+2]环加成反应，生成氧化四氢呋喃环（oxetane ring）。根据醛基和双键在碳链上的相对位置，可以形成两种异构体。随后，通过低能碰撞诱导解离（CID）技术，可以进一步裂解这些环状结构，从而获得两个具有诊断意义的碎片离子。这些碎片离子的稳定性和可分离性使得该方法在串联质谱中具有较高的应用价值。研究团队选择使用2-乙酰吡啶（2-acpy）作为反应试剂，因为它能够显著提高反应的信号强度，并且具有较高的检测灵敏度和重复性。

在实验过程中，研究团队首先对不同脂肪酸异构体进行了Paternò-Büchi反应和质谱分析，以确认其反应行为和碎片特征。随后，他们将该方法应用于人体皮脂样本，并通过定量分析评估了不同性别个体的皮脂脂肪酸组成差异。实验结果显示，17种游离脂肪酸单不饱和脂肪酸（MUFAs）和两种多不饱和脂肪酸（PUFAs）在皮脂中被成功识别。其中，C16:1n-10（ sapienic acid）在所有MUFAs中最为丰富，这表明在皮脂腺中，Δ6脱饱和酶（由FADS2基因编码）在脂肪酸合成过程中占据主导地位。此外，研究还发现MUFAs和PUFAs在男女皮脂中的含量相近，这一结果对于进一步探讨脂肪酸在皮肤生理中的作用具有重要意义。

为了确保分析的准确性和可重复性，研究团队采用了定量分析策略，并引入了同位素标记的内标物（如d14-C16:1）来支持不同脂肪酸异构体的定量评估。通过将内标物与目标脂肪酸进行对比，他们能够更精确地测量皮脂中各脂肪酸异构体的含量。此外，研究还探讨了不同反应条件对Paternò-Büchi反应效率的影响，最终确定了最佳的反应参数，以提高检测的灵敏度和特异性。

在对不同脂肪酸异构体进行详细分析时，研究团队发现，对于具有相同Δ位置的双键，其碎片离子具有一定的相似性，但根据碳链长度的不同，相对n碎片会有所变化。这意味着，通过观察碎片离子的种类和强度，可以有效地识别脂肪酸的双键位置。例如，C16:1n-10和C18:1n-10等异构体在质谱图中表现出不同的碎片特征，从而帮助研究人员区分它们的结构。这种技术不仅提高了对脂肪酸异构体的识别能力，还为后续的定量分析提供了可靠的基础。

研究还发现，某些脂肪酸异构体在不同个体之间存在显著差异。例如，C16:1n-10在男性和女性中的分布情况类似，但C18:2n-6,9（即亚油酸）在男女之间表现出相似的含量，这可能意味着其来源于外源性摄入。相比之下，C18:2n-10,13（即sebaleic acid）在男女之间显示出不同的分布模式，这表明其可能与皮脂腺的内源性合成有关。此外，C18:1n-9（即油酸）和C18:1n-10（即cis-8-oleic acid）在不同性别个体中均被检测到，但它们的含量和分布可能受到不同生理因素的影响。

在对脂肪酸异构体的定量分析中，研究团队发现，C16:1n-10在大多数样本中具有较高的浓度，甚至在部分样本中超过了校准曲线的上限。这表明C16:1n-10在皮脂中起着关键作用。C18:1n-10在约三分之一的样本中也表现出较高的浓度，说明其在皮脂中的含量具有一定的波动性。相比之下，C18:1n-9（油酸）和C18:2n-6,9（亚油酸）在不同个体之间的含量较为稳定，这可能与其来源或代谢途径有关。此外，研究还发现，C18:1n-12等某些脂肪酸异构体在不同个体中含量较低，这可能与其在皮肤中的合成或代谢效率有关。

在定量分析过程中，研究团队通过比较不同浓度的脂肪酸异构体与内标物的面积比，评估了方法的准确性和重复性。结果显示，大多数脂肪酸异构体在不同浓度下表现出良好的线性关系和可重复性，但某些异构体（如C15:1n-9和C18:1n-13）由于含量较低，其重复性相对较差。为了提高这些低浓度脂肪酸的检测准确性，研究团队采用了更高浓度的校准曲线，并结合了同位素标记的内标物进行更精确的定量分析。

此外，研究团队还探讨了不同脂肪酸异构体在不同性别个体中的分布情况。虽然总体上男女之间的脂肪酸含量相近，但某些特定异构体在不同性别中表现出差异。例如，C18:2n-10,13（sebaleic acid）在男女之间的含量差异较为明显，这可能与其合成途径或代谢过程中的性别差异有关。而亚油酸（C18:2n-6,9）则在男女之间表现出相似的含量，这可能意味着其主要来源于饮食，而非皮肤自身的合成。

综上所述，该研究通过结合Paternò-Büchi反应和LC-MS/MS技术，成功开发了一种新的分析方法，用于区分人体皮脂中不同位置的脂肪酸双键。这种方法不仅提高了脂肪酸异构体的识别能力，还为定量分析提供了可靠的技术支持。研究结果表明，C16:1n-10和C18:1n-10等脂肪酸异构体在皮脂中占据主导地位，而亚油酸和sebaleic酸的含量则受到不同来源和代谢途径的影响。这些发现为理解脂肪酸在皮肤生理中的作用提供了新的视角，并可能为相关疾病的诊断和治疗提供新的思路。