优化普通小球藻（Chlorella vulgaris）的产量，并研究其与固氮微藻-2-固定细菌共生体系对种子萌发的影响

《Journal of Biotechnology》：Optimizing Chlorella vulgaris production and exploring its impact on germination through microalga-N 2-fixing bacteria consortia

微藻Chlorella vulgaris与三种固氮细菌在无氮培养基中共培养，显著提高生物质产量（达2.31 g·L?1·d?1），接近添加合成氮的正对照水平。流式细胞术显示藻体活性受细菌共培养影响，但细胞存活率与正对照无显著差异。生物质中蛋白质含量下降（13.7%-38%），脂质含量升高（13.2%-31.6%）， chlorophyll和carotenoids含量因氮限制显著降低。上清液处理使莴苣种子发芽指数提升40%-50%，表明共培养体系产生的代谢物具有生物刺激活性。该研究验证了微藻-固氮菌共生体系在氮循环和可持续农业中的应用潜力。

　　### 研究背景与意义

微藻因其独特的代谢能力和丰富的化学成分，被广泛认为是工业和农业领域的重要资源。它们能够生产多种生物产品，如食品和饲料原料、化妆品、生物塑料、生物制药、营养保健品以及可再生能源等。此外，微藻在废水处理和减少大气二氧化碳浓度方面也发挥着关键作用。在21世纪，随着对可持续发展和环境友好型技术的需求增加，微藻的潜力得到了越来越多的关注。其优势包括独特的代谢途径、高光合效率、无需占用可耕地和饮用水，以及能够每日收获生物质等。然而，尽管微藻具有诸多优点，其大规模应用仍然受到生产与加工成本高的限制。

氮是微藻生长过程中不可或缺的营养元素之一，但传统上需要通过合成氮肥来提供。这不仅增加了生产成本，还对环境造成了较大的负担。因此，寻找替代的氮源成为提高微藻生产可持续性的关键。N?固氮细菌因其能够将大气中的氮气转化为生物可利用的氮形式，被视为一种具有潜力的替代方案。通过与N?固氮细菌的共培养，微藻可以减少对合成氮肥的依赖，从而降低生产成本并减少环境影响。

### 微藻与固氮细菌的共生机制

微藻与固氮细菌之间的共生关系在多个研究中得到了证实。这种关系不仅有助于氮的供应，还能促进碳源的利用。微藻通过光合作用释放氧气并合成有机化合物，这些化合物可以作为固氮细菌的碳源。而固氮细菌则能够将氮气转化为可被微藻吸收的氮形式，从而支持其生长。此外，微藻还能够分泌一些天然的植物激素，如吲哚乙酸（IAA），这进一步增强了其与固氮细菌之间的相互作用。研究表明，微藻与固氮细菌之间的这种相互作用可能比单纯的拮抗或竞争更为复杂和双向。

然而，这种共生关系的优化仍面临一些挑战。例如，如何提高氮的转移效率以及确保足够的氮供应是当前研究的重点。此外，某些固氮细菌可能会释放抑制微藻生长的化合物，从而影响共生效果。因此，研究微藻与不同种类固氮细菌的共培养效果，对于提高生产效率和降低环境影响具有重要意义。

### 实验设计与方法

在本研究中，科学家们采用了一种创新的方法，将微藻与三种N?固氮细菌进行共培养，并且在培养过程中不添加任何外源氮。这种实验设计旨在探索在无氮培养基中，微藻是否能够通过与固氮细菌的共生关系实现有效的生长，并生成具有生物刺激潜力的生物质和上清液。实验中，Chlorella vulgaris被用于测试，并与三种不同的N?固氮细菌进行共培养，分别是Sphingobacterium sp. L13G8、Microbacterium maritypicum M13A8和Serratia ficaria G8L13。这些细菌均来源于亚美尼亚的实验室，具有较强的固氮能力。

为了评估微藻的生长情况，研究人员使用了多种方法，包括干重测量、Fv/Fm比值分析以及流式细胞术。Fv/Fm比值用于衡量光合系统II的光合效率，而流式细胞术则能够提供关于细胞活力和种群动态的详细信息。此外，研究人员还对生物质的组成进行了分析，包括蛋白质、碳水化合物、脂类、叶绿素和类胡萝卜素的含量。

为了评估微藻生物质及其上清液在农业中的应用潜力，研究人员进行了莴苣种子的发芽生物测定。这些实验揭示了微藻及其代谢产物在促进种子发芽方面的作用。通过比较不同条件下的发芽指数（GI），研究人员能够进一步评估共培养体系对植物生长的潜在影响。

### 实验结果与分析

实验结果表明，在无氮培养基中进行共培养的微藻（条件C、D和E）其生物质产量与添加了合成氮肥的正对照（条件B）相比具有可比性。尽管在某些情况下，Fv/Fm比值表明存在一定的生理压力，但总体上，共培养体系仍能够维持较高的生物质产量。这说明微藻与固氮细菌之间存在一定的协同作用，尽管其效果可能受到多种因素的影响。

通过流式细胞术，研究人员发现，共培养体系中的微藻细胞浓度低于正对照，这可能表明固氮细菌对微藻的生长存在一定的抑制作用。然而，所有共培养条件下的微藻细胞活力均与正对照相似，这说明微藻的生长并未受到显著影响。此外，共培养体系中的细菌数量在实验初期高于正对照，但在实验结束时有所下降，这可能与培养基中缺乏碳源有关。

在生物质组成方面，研究人员发现，无氮条件下的微藻（条件A）其蛋白质含量显著低于正对照，而脂类含量则有所增加。这可能是因为氮的缺乏导致微藻将更多的碳资源分配给脂类的合成。相比之下，共培养体系中的微藻脂类含量与正对照相近，但蛋白质含量有所下降。这些结果表明，微藻在与固氮细菌共培养时，其代谢途径可能受到一定的影响，导致蛋白质合成减少，脂类积累增加。

在农业应用方面，所有微藻培养物（包括正对照和共培养条件）在0.2 g·L?1的浓度下均显著提高了莴苣种子的发芽指数。其中，条件A（无氮培养）和条件E（与Serratia ficaria G8L13共培养）的发芽指数提高了40%和50%。这表明，即使在没有外源氮的情况下，微藻与固氮细菌的共培养也能有效促进种子发芽。此外，上清液的使用也显示出了良好的效果，某些条件下的上清液能够显著提高发芽指数，达到超过40%的提升。

### 讨论与意义

本研究的结果表明，微藻与N?固氮细菌的共培养是一种可行的替代方案，可以有效降低氮肥的使用量，同时维持较高的生物质产量。这种共培养体系不仅有助于减少对合成氮肥的依赖，还能通过微生物间的相互作用促进微藻的生长和代谢产物的积累。然而，实验中也发现了一些问题，如某些共培养条件下的Fv/Fm比值较低，这可能表明微藻在与固氮细菌的相互作用中存在一定的生理压力。

此外，研究还发现，共培养体系中的微生物群落变化可能对微藻的生长产生影响。例如，某些固氮细菌可能释放了对微藻不利的化合物，从而影响其生理状态。因此，未来的研究需要进一步探讨这些微生物间的相互作用机制，以优化共培养条件并提高微藻的生长效率。

在农业应用方面，微藻及其上清液被证明具有显著的生物刺激作用。这不仅为农业提供了新的生物肥料来源，还为可持续农业和循环经济策略提供了支持。通过利用微藻的代谢产物，可以有效提高土壤肥力和植物生长，同时减少对化学肥料的依赖。

### 结论与展望

本研究的结果为微藻与N?固氮细菌的共培养提供了新的视角，表明这种共生关系可以在不依赖合成氮肥的情况下实现有效的微藻生产。尽管在某些条件下，微藻的生长受到一定限制，但整体来看，共培养体系能够维持较高的生物质产量，并且在农业应用中表现出良好的潜力。这一发现不仅有助于降低微藻生产的成本，还对环境保护具有重要意义。

然而，为了进一步实现共培养体系的潜力，还需要更多的研究来优化氮的转移效率，并确保固氮细菌的稳定生长。此外，对于不同条件下的微生物相互作用机制，也需要更深入的探讨。未来的研究可以关注如何通过调整培养条件和选择合适的固氮细菌，以最大程度地发挥微藻与固氮细菌之间的协同作用，从而实现更高效的生物质生产。