综述：Komagataella phaffii 作为一种用于生产抗菌肽的微生物细胞工厂

《Journal of Biotechnology》：Komagataella phaffii as a microbial cell factory for antimicrobial peptide production

抗菌肽（AMPs）的异源表达中，Komagataella phaffii因快速生长、高效分泌及翻译后修饰能力成为重要平台。本文系统评述其AMPs生产策略，包括AOX1启动子调控、密码子优化、工程菌株构建等，探讨产率提升与稳定性优化挑战，强调其在生物制造中的经济性与安全性优势。

　　在近年来的研究中，甲醇营养酵母 *Komagataella phaffii*（曾被称为 *Pichia pastoris*）逐渐成为异源表达抗菌肽（Antimicrobial Peptides, AMPs）的重要平台。作为一种经济且可扩展的生产系统，*K. phaffii* 具备多种优势，使其在生物技术领域中备受关注。其快速生长的特性、高密度细胞培养能力、高效的蛋白质分泌机制以及能够进行关键的翻译后修饰，使得该酵母成为表达具有生物活性的AMPs的理想宿主。此外，其对甲醇的代谢能力以及对特定启动子的调控能力，也为AMPs的大规模生产提供了有力支持。

抗菌肽是一类广泛存在于植物、昆虫、动物和人类中的小分子多肽，其长度通常在5到50个氨基酸之间。这些多肽是先天免疫系统的重要组成部分，能够对抗多种病原微生物，包括细菌、真菌和病毒。由于抗菌肽具有广谱抗菌活性，它们在医学、食品和化妆品行业中展现出巨大的应用潜力。抗菌肽不仅能够直接破坏微生物的细胞膜，还能够通过非破坏性机制进入细胞内部，干扰其生理功能。这种多样的作用方式，使其成为治疗感染性疾病、调节免疫反应以及对抗癌细胞等疾病的候选药物。

尽管抗菌肽具有诸多优点，但其生产仍面临一定挑战。传统的方法主要依赖于从天然来源直接提取或者化学合成。然而，这两种方法都存在局限性。例如，天然提取过程可能对环境造成影响，并且由于来源生物在特定压力条件下才产生抗菌肽，因此产量较低。化学合成虽然能够获得高纯度的抗菌肽，但其成本较高，且对于较长的肽链或含有二硫键的结构，合成难度较大。此外，化学合成过程中使用的有机溶剂，如二氯甲烷（DCM）、四氢呋喃（THF）和二甲基甲酰胺（DMF）等，不仅对环境造成污染，还可能增加生产成本。因此，寻找一种可持续且高效的抗菌肽生产方法成为当前研究的重点。

异源表达系统为解决上述问题提供了一种可行的策略。选择合适的宿主生物是异源表达的关键环节，需要根据目标肽的特性进行评估。酵母作为异源表达的宿主，因其易于操作、生长迅速、能够进行真核翻译后修饰以及高效的蛋白质分泌能力，成为生产抗菌肽的优选平台。特别是 *K. phaffii*，其在异源表达系统中的应用日益广泛，展现出独特的潜力。该酵母不仅能够实现高细胞密度和高蛋白产量，还能够在无菌、无病毒污染的环境中进行生产，从而确保产品的安全性。

*K. phaffii* 的异源表达能力主要依赖于其特有的甲醇诱导启动子，如 *AOX1* 启动子。该启动子在甲醇存在时被激活，能够实现对目标基因的高效表达。这一特性使得 *K. phaffii* 在工业生产中具有显著优势，因为它可以灵活地控制表达水平，从而避免过度表达可能带来的代谢负担。此外，通过使用不同的载体和表达策略，研究人员可以进一步优化抗菌肽的产量和质量。例如，使用 pPICZalpha 等载体，结合 codon optimization（密码子优化）和工程化甲醇耐受菌株，可以提高目标肽的翻译效率和稳定性。

然而，尽管 *K. phaffii* 在抗菌肽生产方面表现出色，仍存在一些需要克服的挑战。其中，蛋白酶降解是影响抗菌肽产量和功能的主要问题之一。在酵母的细胞内，尤其是内质网和高尔基体中，存在多种蛋白酶，这些酶可能对分泌的抗菌肽造成降解，影响其生物活性。此外，抗菌肽在细胞外环境中也可能受到外源蛋白酶的影响，导致其结构受损或活性降低。因此，研究人员正在探索多种策略来减少蛋白酶的降解作用，例如通过工程化改造酵母的蛋白酶活性、使用蛋白酶抑制剂或设计具有更高稳定性的抗菌肽结构。

另一个关键挑战是抗菌肽的产量优化。尽管 *K. phaffii* 具备高效的蛋白质分泌能力，但不同抗菌肽的表达效率可能存在差异。这可能与目标肽的序列特性、启动子强度、翻译后修饰需求以及细胞培养条件等多种因素有关。为了提高抗菌肽的产量，研究人员通常会采用多种策略，包括调整培养基成分、优化培养条件（如温度、pH值和甲醇浓度）、使用高表达载体以及引入辅助蛋白以促进肽的折叠和分泌。此外，一些研究还表明，通过引入不同的分泌信号肽，可以进一步提高抗菌肽的分泌效率，从而增加其在培养液中的浓度。

在实际应用中，*K. phaffii* 还需要满足特定的工业需求。例如，抗菌肽的生产需要适应大规模发酵的条件，同时保证其在不同环境下的稳定性和生物活性。这不仅涉及到酵母的培养工艺，还涉及到抗菌肽的纯化和储存方法。此外，抗菌肽的药理特性也需要在表达过程中得到充分保留，以确保其在治疗应用中的有效性。因此，研究人员正在探索如何通过基因工程手段，使抗菌肽在酵母中正确折叠，并且具备与天然来源相同的生物活性。

为了提高抗菌肽的生产效率，一些研究还尝试通过工程化改造酵母的基因组，使其更适合抗菌肽的表达。例如，通过敲除某些蛋白酶基因，可以减少抗菌肽在细胞内的降解，从而提高其分泌效率。此外，一些研究还开发了甲醇耐受的酵母菌株，使其能够在高浓度甲醇环境中持续生长，从而提高抗菌肽的产量。这些工程化菌株不仅能够增强抗菌肽的表达能力，还能够降低生产成本，提高经济效益。

在抗菌肽的应用方面，*K. phaffii* 作为表达系统的优势尤为突出。由于其能够进行真核翻译后修饰，因此可以生产出具有更复杂结构和更高生物活性的抗菌肽。这对于某些需要特定修饰才能发挥功能的抗菌肽尤为重要。此外，*K. phaffii* 还能够实现高密度细胞培养，使得抗菌肽的生产能够在较短的时间内达到较高的产量，这对于工业化生产具有重要意义。

随着生物技术的不断发展，*K. phaffii* 在抗菌肽生产中的应用也不断拓展。研究人员正在探索其在不同领域中的潜力，包括医学、食品和化妆品行业。在医学领域，抗菌肽被用于开发新型抗生素，以应对日益严重的抗生素耐药问题。在食品行业，抗菌肽可以作为天然防腐剂，用于延长食品的保质期并提高食品安全性。在化妆品行业，抗菌肽则被用于开发具有抗菌和抗炎作用的护肤产品。这些应用不仅拓展了抗菌肽的市场前景，也进一步凸显了 *K. phaffii* 作为表达系统的广泛适用性。

然而，要实现抗菌肽的高效生产，还需要进一步解决一些关键问题。例如，如何提高抗菌肽的稳定性，如何优化其分泌效率，以及如何确保其在不同环境下的生物活性。此外，还需要考虑抗菌肽的规模化生产是否符合工业标准，以及其在实际应用中的安全性和有效性。这些问题的解决将有助于推动抗菌肽在医疗、食品和化妆品等领域的应用，同时也将提高 *K. phaffii* 作为表达系统的实用价值。

总的来说，*Komagataella phaffii* 作为一种高效的异源表达系统，在抗菌肽的生产中展现出巨大的潜力。其快速生长、高密度培养、高效分泌以及能够进行真核翻译后修饰等特性，使其成为生产具有生物活性的抗菌肽的理想宿主。尽管在实际应用中仍面临一些挑战，如蛋白酶降解和产量优化，但随着基因工程和发酵技术的不断进步，这些问题有望得到逐步解决。未来，*K. phaffii* 可能会成为抗菌肽工业化生产的核心平台，为生物技术领域的发展做出重要贡献。