抑制mab_1999基因表达影响脓肿分枝杆菌生长和细胞形态的机制研究及其对β-内酰胺类抗生素敏感性的增强作用

本研究针对脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）细胞分裂关键蛋白FtsL同源基因mab_1999的功能展开探索。研究人员通过CRISPR干扰（CRISPRi）技术构建基因敲低菌株，发现mab_1999表达抑制会导致细胞伸长、生长缺陷，并显著增强对β-内酰胺类抗生素（如ceftriaxone和imipenem）的敏感性。该研究揭示了mab_1999在细胞分裂和细胞壁完整性维持中的重要功能，为针对耐药性分枝杆菌的新型抗菌策略提供了重要理论基础。

　　

在微生物感染领域，脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）作为一种快速生长的非结核分枝杆菌（NTM），已成为肺部感染和软组织感染的重要病原体。由于其固有的和获得性耐药机制，该菌对多种抗菌药物表现出广泛耐药性，常常导致治疗失败和不良预后，成为临床治疗的重大挑战。细菌细胞分裂是细菌生存的核心过程，也是新型抗生素开发的潜在靶点。在分枝杆菌中，细胞分裂系统与大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等模式生物存在显著差异，尽管许多保守的细胞分裂蛋白已被鉴定，但其调控机制在不同菌种间可能有所变化。目前，对分枝杆菌细胞分裂的研究主要集中于模型生物如耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）和结核分枝杆菌（M. tuberculosis），而脓肿分枝杆菌中细胞分裂蛋白的调控和功能作用却知之甚少。

FtsL是一种高度保守的蛋白，在细胞分裂和伸长过程中起关键作用。在耻垢分枝杆菌中，FtsL（MSMEG_4234）被证明对细胞分裂至关重要，其缺失会导致细胞伸长和致死。然而，其在脓肿分枝杆菌中的同源蛋白MAB_1999的功能尚不明确。为此，Azizah Fitriana Nurul Ilmi等研究人员在《BMC Microbiology》上发表了题为“Repression of mab_1999 impairs growth and alters cellular morphology of Mycobacterium abscessus”的研究论文，旨在探究MAB_1999在脓肿分枝杆菌生长、细胞形态和抗生素敏感性中的功能。

研究人员运用生物信息学分析、CRISPR干扰（CRISPRi）技术、细菌生长与活力测定、形态学观察（包括抗酸染色和扫描电子显微镜）、基因表达分析（qPCR）以及抗生素药敏试验（微量肉汤稀释法）等多种技术手段，对脓肿分枝杆菌标准菌株ATCC 19977进行了深入研究。

Characteristics of MAB_1999

通过BLASTp分析，研究人员鉴定出MAB_1999是脓肿分枝杆菌中FtsL的推定同源蛋白，该蛋白由323个氨基酸组成，与耻垢分枝杆菌的FtsL（MSMEG_4234）具有54%的氨基酸序列一致性。序列比对显示，不同分枝杆菌属的FtsL同源蛋白整体氨基酸序列一致性为59.3%，且均具有FtsL蛋白家族典型的细胞质、跨膜和周质结构域。基因定位分析发现，mab_1999基因（972 bp）位于保守的细胞分裂基因簇中，其旁侧基因分别为编码16S rRNA甲基转移酶的rsmH（mab_1998）和编码青霉素结合蛋白PbpB的pbpB（mab_2000），这种保守的共线性结构支持了mab_1999作为脓肿分枝杆菌ftsL同源基因的注释。

mab_1999 gene repression via CRISPR interference

为研究mab_1999的功能，研究团队利用CRISPRi系统构建了mab_1999敲低菌株（mab_1999_KD）。当使用500 ng/mL无水四环素（ATc）诱导后，mab_1999_KD菌株中mab_1999的表达显著降低，在诱导后24小时和72小时均观察到约6倍的表达下调，与未诱导对照组相比，表达减少具有统计学显著性。

mab_1999 gene knockdown results in growth defects

生长实验表明，500 ng/mL ATc诱导会损害mab_1999_KD菌株在固体培养基上的生长，但并未导致完全生长抑制。在液体培养中，诱导mab_1999抑制后，细菌活力（CFU/mL）在36小时、48小时和72小时均显著降低。与空载体对照菌株相比，这种生长缺陷也具有统计学显著性。值得注意的是，72小时后，随着培养时间延长，生长缺陷逐渐减弱，OD₆₀₀和CFU/mL均呈现上升趋势。

mab_1999 knockdown alters the cellular morphology of Mycobacterium abscessus

形态学观察显示，mab_1999表达抑制导致细菌细胞伸长和分支化。这种伸长表型在诱导后24小时内尤为明显，随着培养时间延长至144小时，细胞逐渐恢复较短形态。扫描电子显微镜（SEM）观察未发现mab_1999_KD菌株细胞表面存在显著变化。

mab_1999 gene knockdown increased sensitivity to antibiotics

抗生素敏感性试验表明，mab_1999表达抑制显著增强了脓肿分枝杆菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性。在无ATc诱导条件下，mab_1999_KD菌株对头孢曲松（CTX）和亚胺培南（IMP）的MIC值分别大于512μg/mL和8μg/mL。而在500 ng/mL ATc诱导下，该菌株在64μg/mL CTX或1μg/mL IMP浓度下即出现生长抑制。

研究结论表明，MAB_1999作为FtsL的推定同源蛋白，在脓肿分枝杆菌的细胞分裂过程中扮演重要角色。其表达抑制会导致细胞分裂缺陷，表现为细胞伸长和生长速率下降，同时还会增加细菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性。这些发现表明MAB_1999可能通过影响细胞壁完整性来调节抗生素敏感性，为理解脓肿分枝杆菌的细胞分裂机制和耐药性提供了新见解。然而，研究人员也指出，需要进一步的研究来完全确认MAB_1999作为FtsL的身份，并阐明其在细胞分裂过程和细胞壁合成中的具体作用机制。该研究为开发针对耐药性分枝杆菌的新型治疗策略提供了重要的理论基础，特别是在联合使用β-内酰胺类抗生素针对细胞分裂靶点的治疗策略方面具有潜在应用价值。