内皮细胞与成骨细胞通过Notch信号通路调控ALP表达及RANKL/OPG比值的体外互作机制研究

本研究针对骨重塑过程中成骨与血管生成相互作用的复杂机制，通过建立原代人成骨细胞（hOBs）与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的直接共培养模型，探讨了地塞米松（Dex）和血管内皮生长因子（VEGF）对碱性磷酸酶（ALP）活性及RANKL/OPG比值的调控作用。研究发现VEGF通过Notch信号通路（NOTCH1/DLL4轴）特异性增强共培养体系中的ALP活性，而内皮细胞通过Notch非依赖途径调控RANKL/OPG比值。该研究为糖皮质激素性骨质疏松机制提供了新见解，并强调了多细胞共培养模型在骨代谢研究中的重要性。

　　

骨骼作为高度血管化的活组织，始终处于动态重塑过程中。这一精密过程需要成骨细胞（osteoblasts, OBs）与破骨细胞的协同作用，并在骨细胞调控下维持平衡。值得注意的是，成骨过程与血管生成（angiogenesis）存在着密不可分的耦合关系——血管不仅为骨组织提供氧气和营养，还负责运输钙、磷酸盐等无机离子，这些对于骨矿化至关重要。然而，传统的体外骨模型往往忽视这种细胞间相互作用，多数研究仅使用永生化细胞系且缺乏内皮细胞成分，难以真实模拟体内复杂的微环境。

更令人困扰的是，临床上常用的抗炎药物地塞米松（dexamethasone, Dex）虽然疗效显著，但其诱发骨质疏松的副作用机制尚未明确。同时，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）作为连接血管生成与成骨过程的关键因子，其在骨代谢中的具体调控机制仍需深入探索。正是为了破解这些难题，德累斯顿工业大学的研究团队在《Cellular & Molecular Biology Letters》上发表了创新性研究成果，通过建立原代人类成骨细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的直接共培养体系，揭示了细胞间对话的分子机制。

研究团队采用来自人工髋关节置换患者的原代成骨细胞（4例不同供体）与商品化HUVECs（2例供体）建立直接共培养模型，通过14天的培养周期，结合荧光显微镜形态观察、基因表达分析（qPCR）、蛋白活性检测（ALP活性测定）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等技术手段，系统评估了不同处理条件下细胞的响应。实验设置了七种培养基条件，包括对照组、Dex处理组、VEGF处理组（10/20 ng/mL）、Dex+VEGF组合组以及VEGF与Notch抑制剂DAPT联合处理组，所有培养基均含有维持成骨分化的必需添加剂β-甘油磷酸酯（β-GP）和抗坏血酸-2-磷酸（AAP）。

Dex与VEGF在共培养体系中协同增强ALP活性

研究发现，Dex单独处理能够显著提高单培养和共培养体系中的ALPL基因表达和ALP活性，这与既往研究中Dex的促成骨分化作用一致。然而，当在共培养体系中同时加入Dex和VEGF时，ALP活性出现叠加效应，这种增效作用在成骨细胞单培养中完全缺失。值得注意的是，20 ng/mL VEGF单独处理也能显著提升共培养体系的ALP水平，且Notch抑制剂DAPT能够完全阻断VEGF诱导的ALP升高，提示内皮细胞通过Notch信号通路介导了对成骨细胞分化的调控。

VEGF逆转Dex对RANKL/OPG比值的抑制作用且不依赖Notch信号

在RANKL/OPG系统调控方面，Dex单独处理显著降低了成骨细胞中RANKL基因表达，这一现象在单培养和共培养体系中均存在。然而，在共培养体系中添加VEGF后，Dex的抑制效应被完全逆转——RANKL表达显著上调而OPG表达下降，导致RANKL/OPG比值升高。这种调控具有细胞类型特异性，在成骨细胞单培养中未见类似现象。更重要的是，DAPT处理并未影响VEGF对RANKL/OPG比值的调控作用，表明内皮细胞通过Notch非依赖途径影响骨吸收相关因子。

Notch信号通路在共培养体系中被特异性激活

基因表达分析显示，NOTCH1、DLL4和JAG1等Notch信号通路关键分子在VEGF处理的共培养体系中显著上调，其中NOTCH1和DLL4的诱导最为明显。这种激活具有严格的细胞环境依赖性，在成骨细胞单培养中完全缺失。Notch抑制剂DAPT处理虽然未能降低Notch受体和配体的基因表达（因其主要抑制NICD的转录活性），但有效抑制了下游的ALP活性升高。

VEGF促进内皮细胞管状结构形成而Dex产生抑制作用

形态学观察发现，只有在VEGF存在的条件下，HUVECs才能形成密集的管状网络结构。Dex处理则导致内皮细胞聚集成簇状，管状结构形成能力受损。当Dex与VEGF联合使用时，血管网络密度明显降低。DAPT处理也破坏了VEGF诱导的管状结构形成，进一步证实Notch信号在内皮细胞功能调控中的关键作用。

这项研究最终得出结论：内皮细胞与成骨细胞之间的相互作用在骨重塑过程中发挥着至关重要的作用。VEGF通过激活Notch信号通路（特别是NOTCH1-DLL4/JAG1轴）显著增强成骨细胞的ALP活性，这可能通过诱导BMP-2和BMP-9等成骨分化因子实现。同时，内皮细胞通过Notch非依赖途径调控RANKL/OPG比值，这种调控在VEGF存在下能够逆转Dex的抑制作用。

这些发现不仅为理解骨微环境中细胞间通信提供了新视角，更重要的是为糖皮质激素性骨质疏松的机制提供了创新性解释——内皮细胞可能通过分泌尚未明确的因子参与骨吸收过程的调控。研究还强调了复杂多细胞模型在骨生物学研究中的价值，这种更加生理相关的实验体系能够更好地模拟体内环境，为减少动物实验依赖提供了可行方案。该研究的发现对未来开发针对骨质疏松的新型治疗策略，特别是针对血管-骨相互作用的靶向疗法，具有重要的指导意义。