外切酶融合CRISPR-Cas系统显著增强大豆靶向基因组编辑能力

本研究针对CRISPR/Cas系统在大豆基因组编辑中主要产生小片段插入/缺失（indels）的局限性，创新性地将T5外切酶（5'-3'方向）和TREX2外切酶（3'-5'方向）分别与Cas9和Cas12a融合，通过发根农杆菌介导的转化和深度扩增子测序技术，系统评估了这些融合系统在GmWOX5位点的编辑性能。结果表明，外切酶融合显著提高了中等（26-50 bp）和大片段（>50 bp）缺失的频率，并减少了插入事件，为靶向顺式调控元件和microRNA等功能基因组学研究提供了高效工具。

　　

在植物生物技术领域，CRISPR/Cas基因组编辑技术的出现带来了革命性的变化，使研究人员能够以前所未有的便捷性实现精确高效的遗传修饰。然而，尽管Cas9和Cas12a等核酸酶在植物和动物研究中被广泛应用，它们存在一个关键局限性：由于其依赖于细胞内的非 homologous末端连接（NHEJ）修复途径，这些系统往往主要产生小片段的插入或缺失（indels），通常Cas9产生1-5 bp的变异，而Cas12a产生2-13 bp的变异。这种偏向性严重限制了它们在功能基因组学中的应用，特别是在研究顺式调控元件、增强子/抑制子、转录因子结合位点和microRNA（miRNA）结合区域时，这些功能元件通常需要10-40 bp甚至更大的缺失才能完全破坏其功能。

传统上，为了产生更大的缺失，研究人员通常设计多个gRNA，但这种方法不仅 labor-intensive，尤其是在需要克隆超过4个gRNA时，而且会导致相对不可预测的缺失大小。此外，在miRNA结合位点，产生较大的缺失（移除miRNA生物生成和成熟序列）往往是必要的，因为并非所有小缺失都足以完全废除基因功能，它们对二级结构和加工的可变影响可能导致功能残留。从技术角度来看，中等至大片段缺失有助于开发更精确和信息丰富的基因组编辑分析。小片段indels，尤其是那些低频和异质性编辑谱的，通常需要针对靶位点附近进行高深度测序，而大片段缺失可以通过长距离PCR和 advanced测序方法检测，从而能够同时分析大片段缺失和小片段indels。

为了克服这些限制，由Vikas Devkar、Kaushik Ghose、Leonidas D'Agostino和Gunvant B. Patil组成的研究团队在《BMC Plant Biology》上发表了他们的最新研究成果。他们开发并系统评估了外切酶融合的CRISPR/Cas系统在大豆中的应用，以扩展CRISPR工具包，实现高效、靶向生成 larger deletions。研究团队选择了两种外切酶：来自T5噬菌体的T5外切酶（T5 Exonuclease, T5 Exo），具有5'到3'的外切酶活性；和来自人类的三 prime修复外切酶2（TREX2），具有3'到5'的外切酶活性，主要参与错配修复。将这些外切酶与Cas9和Cas12a融合，旨在 alter修复结果，促进更大的缺失。

研究团队使用了多种关键技术方法：通过分子克隆构建了外切酶（T5和TREX2）与Cas9或Cas12a的融合表达载体，使用XTEN linker连接，并由enhanced 35S promoter驱动表达；利用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的转化在大豆子叶中产生转基因毛状根，并通过荧光显微镜筛选GFP阳性根；采用CTAB法提取基因组DNA，并通过深度扩增子测序（deep amplicon sequencing）分析编辑效率和突变谱，使用CRISPResso2工具进行数据分析。

研究团队首先设计了外切酶与Cas核酸酶的融合构建体。将T5和TREX2外切酶分别融合到SpCas9和ttLbCas12a（温度耐受型Cas12a）的N端，使用灵活的XTEN linker连接。Cas和外切酶融合基因由enhanced 35S promoter驱动表达。对于两种核酸酶，针对GmWOX5基因（Glyma.02G254800）设计了单gRNA，该基因在大豆根尖分生组织中表达，其在拟南芥中的同源物在维持根干细胞身份和分生组织 organization中起关键作用。

总体突变效率分析显示，Cas9及其外切酶融合 consistently实现了高突变效率（>75%），而Cas12a及其融合表现出中等效率（41-85%）。与天然Cas9和Cas12a相比，融合外切酶后总体突变效率有所降低，这可能 due to外切酶融合引入的 steric hindrance。插入和缺失百分比评估表明，Cas9表现出最高的插入百分比（21%），而T5 Exo-Cas9（2.3%）和TREX2-Cas9（0.2%）融合显著减少了插入，表明这些外切酶产生更精确的缺失谱。

缺失大小谱评估结果显示，Cas9主要产生 micro deletions（1-10 bp；84%），而T5 Exo-Cas9显著改变了缺失谱，产生27%的中等缺失（26-50 bp）和12%的大片段缺失（>50 bp）。TREX2-Cas9融合 favored small-sized deletions（11-25 bp；67%），约24%的缺失处于中等和大片段范围。对于Cas12a，天然酶主要产生 micro deletions（71%）和21%的 small deletions（11-25 bp），而T5 Exo-Cas12a融合产生了55%的中等缺失和11%的大片段缺失，TREX2-Cas12a主要 yield 51%的 small deletions和40%的中等和大片段缺失。

缺失位置分析表明，两种外切酶融合的缺失都主要发生在PAM-proximal端。对于T5 Exo-Cas9和TREX2-Cas9融合，分别有67%和69%的缺失发生在PAM-proximal端。类似地，T5 Exo-Cas12a showed 63%的缺失偏向PAM-proximal端。这种位置偏向性反映了改变的修复结果， likely due to方向性外切酶活性和增强的末端切除。

研究结论和讨论部分强调，外切酶融合显著扩展了CRISPR/Cas9和Cas12a编辑工具包在大豆中的应用。TREX2融合可靠地产生中等缺失（11-25 bp），而T5-Exo融合显著增加大片段缺失（26-50 bp）的频率，这些对于 disrupt调控区域、蛋白质结构域或非编码RNA非常理想。这种策略提供了一种 robust、单gRNA-based的方法来产生有影响的突变，而无需双gRNA设计或 extensive筛选。这些工具为大豆和其他作物的性状发现和调控基因组学提供了有价值的策略。

然而，外切酶融合的应用也存在 certain限制。大外切酶结构域的融合可能会阻碍Cas蛋白折叠和DNA结合，导致总体突变效率降低，如本研究中所观察到的。这可能是 due to steric hindrance、改变的蛋白构象或受损的核酸酶活性。T5外切酶在Cas9和Cas12a融合中产生相对较高频率的较大缺失，可能是 due to其内在的酶活性：T5外切酶具有 processive 5'到3'外切酶活性、灵活的结构特征允许容纳 diverse DNA构象，以及更广泛的底物多功能性。相比之下，TREX2是一种非 processive 3'到5'外切酶，具有严格的底物特异性和结构约束，限制降解程度。

总的来说，外切酶与Cas9和Cas12a的融合显著增加了靶位点较大缺失的频率，解决了标准CRISPR系统的关键限制。这些外切酶融合将允许有效靶向大豆中的顺式调控元件和microRNA位点， enabling fine-tuned基因调控用于未来作物改良策略。研究结果表明，这些外切酶-Cas融合产生的DNA断裂与天然核酸酶相比被 differently处理。这种改变的修复机制可能改变典型短indels的平衡，转而 favoring更大、更 clean的缺失。这种转变可能是 due to增强的末端切除或修复途径选择的调制，最终提高基因组编辑的精确度和 utility用于功能研究。