在甘蓝品种‘Mendel’中发现了第二个抗四种Plasmodiophora brassicae致病型的基因

《Geobios》：A second gene for resistance to four pathotypes of Plasmodiophora brassicae identified in the Brassica napus cultivar ‘Mendel’

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　　在加拿大油菜种植业中，一种名为“clubroot”（根肿病）的病害正对农业生产构成严重威胁。该病害由专性寄生真菌*Plasmodiophora brassicae*引起，导致油菜根部形成肿胀的“galls”，从而严重干扰其水分和营养的吸收，造成高达30%至100%的产量损失。为了有效应对这一挑战，科学家们正在通过遗传抗性手段，寻找能够抵御新出现病原体变种的抗性基因。本文描述了一项关于加拿大油菜品种“Mendel”中一种新的抗性基因*Rcr3*^Mendel的鉴定与定位研究，旨在为抗病育种提供新的基因资源。

### 1. 项目背景与重要性

油菜（*Brassica napus*）是全球重要的油料作物之一，主要生长在温带地区，其产量对加拿大乃至全球的农业经济具有重要影响。然而，自2003年在加拿大草原地区首次发现根肿病以来，该病害已迅速传播，截至2020年，已确认超过3300个田间感染案例。由于病原体能够长期存活在土壤中，且其变种不断演化，现有的抗病品种逐渐失去效果，因此需要不断寻找新的抗性基因并将其引入育种程序中，以确保长期有效的病害控制。

在这一背景下，研究团队通过构建一个由137条双单倍体（DH）线组成的群体，利用基因组测序技术（GBS）和基因分型技术，探索了“Mendel”品种对三种新型病原体变种（3D、5C和8J）的抗性机制。这些变种因其对早期抗病品种的突破性能力而受到关注。通过分析DH群体中抗性性状与基因型之间的关系，研究者成功定位了一种与抗性相关的数量性状位点（QTL），并将其命名为*Rcr3*^Mendel。

### 2. 实验设计与材料准备

为了进行抗性基因的鉴定，研究团队首先选择了两个亲本：一个是高感病的DH16516，另一个是具有抗性的“Mendel”品种。DH16516属于春油菜类型，而“Mendel”则是一个冬油菜品种，来源于欧洲的油菜杂交种。通过将DH16516与“Mendel”进行杂交，得到了F₁代植株，随后通过微孢子培养技术（microspore culture）建立了DH群体。该方法能够在短时间内生成大量遗传背景一致的DH个体，便于进行基因定位和抗性研究。

为了评估抗性性状，研究团队在实验温室中对DH群体进行了为期数年的病原体接种实验。使用了多种抗病品种作为对照，如AAFC-Y12和AAFC-Y68，这些品种携带已知的抗病基因，如*Rcr9*^ECD01和*Rcr10*^ECD01。同时，他们还利用了DH16516作为感病对照。接种后，对根部肿胀程度进行了评分，根据评分结果计算了病害严重度指数（DSI），并以此判断植株是否具有抗性。

### 3. 抗性性状的遗传分析

在DH群体中，研究团队观察到DSI值在不同病原体变种之间存在高度相关性（相关系数*r* ≥ 0.82），表明抗性可能由同一基因或紧密连锁的基因控制。进一步的遗传分析表明，抗性在群体中以3:1的比例分布，这一比例支持抗性由两个基因共同控制的假设。然而，通过GBS和KASP（竞争等位特异性PCR）技术，研究团队最终在染色体A08上定位了一个主要的抗性基因，即*Rcr3*^Mendel。

*Rcr3*^Mendel被映射到一个317 kb的区间内，其两侧的标记为ZS_A08_15999175和ZS_A08_16316110。该区域共鉴定了43个基因，其中只有一个TIR-NBS-LRR（TNL）基因*BnaA08T0102200ZS*与抗性性状显著相关。TNL基因在植物抗病机制中起着关键作用，它们通常编码具有免疫功能的蛋白质，能够识别病原体并触发防御反应。

### 4. 抗性基因的鉴定与验证

为了进一步验证*Rcr3*^Mendel的抗性功能，研究团队对DH群体中的一部分个体进行了对病原体3H的抗性测试。结果显示，这些个体的抗性反应与对5C、3D和8J的抗性高度一致，从而支持*Rcr3*^Mendel与*Rcr3*基因具有相同的功能。此外，KASP分析揭示了八个与*Rcr3*^Mendel共分离的标记，这些标记被用于构建基因图谱并精确定位抗性基因的位置。

研究团队还比较了*Rcr3*^Mendel与*B. rapa*中已知的抗性基因（如*Rcr9*和*Rcr3*）之间的关系。尽管*Rcr3*^Mendel与*Rcr9*^ECD01和*Rcr9*^wa位于同一染色体区域，但它们的抗性谱不同，说明*Rcr3*^Mendel是一个独立的抗性基因。这一发现对于未来抗病品种的育种具有重要意义，因为这意味着可以通过引入新的抗性基因，提高作物对病原体变种的抵抗能力。

### 5. 抗性基因的生物学功能

*BnaA08T0102200ZS*基因是*Rcr3*^Mendel的候选基因之一，其编码的蛋白质属于TIR-NBS-LRR家族，这是植物抗病基因的典型结构。该基因在病原体侵染后能够激活免疫反应，帮助植物抵御感染。此外，该基因在*B. rapa* ECD 04品种中也存在同源基因，即*BraA08g039211E*和*BraA08g039212E*，这些基因同样与抗性相关。

研究团队还通过BLAST分析，将*BnaA08T0102200ZS*与*Arabidopsis thaliana*中的基因*AT5G51630*进行了比对，发现其在结构和功能上具有高度相似性。这表明，油菜的抗病基因可能与拟南芥的抗病基因存在进化上的保守性，进一步支持其在植物免疫系统中的重要作用。

### 6. 群体遗传学与基因定位

在构建DH群体的过程中，研究团队观察到显著的基因分离偏差（segregation distortion），这可能与微孢子培养过程中某些基因的偏好性表达或染色体不稳定有关。尽管这种偏差可能影响基因定位的准确性，但仍有多个植株表现出强烈的抗性反应（DSI接近0%），这表明*Rcr3*^Mendel是一个具有显性效应的抗性基因。

通过GBS技术，研究团队成功鉴定了2642个高质量的SNP标记，并将其用于构建基因图谱。这些标记分布在19条染色体上，覆盖了整个A基因组。通过进一步的QTL分析，研究团队确定了*Rcr3*^Mendel所在的区间，并将其与*B. rapa*中的对应区域进行了比对。结果显示，该区域在*B. rapa*中与*Rcr3*和*Rcr9*等抗性基因有关，但具体作用机制仍需进一步研究。

### 7. 抗性基因的潜在应用

*Rcr3*^Mendel的发现为油菜抗病育种提供了新的基因资源。该基因不仅对3D、5C和8J等新型病原体变种具有抗性，还可能对其他未被充分研究的病原体变种（如3H）具有交叉抗性。这意味着，通过将*Rcr3*^Mendel引入到现有的抗病品种中，可以增强其对多种病原体的防御能力，从而提高作物的抗病性。

此外，研究团队还开发了一系列与*Rcr3*^Mendel紧密连锁的SNP标记，这些标记可以用于快速筛选具有抗性的油菜品种。这一方法不仅提高了育种效率，还减少了传统抗性筛选所需的时间和资源。未来，这些标记有望被应用于大规模的抗病育种计划，以培育出更具抗病性的油菜品种。

### 8. 研究的意义与展望

本研究的成果对于加拿大乃至全球的油菜种植业具有重要意义。随着病原体的不断变异，传统的抗病品种逐渐失效，因此需要不断寻找新的抗性基因并将其整合到育种过程中。*Rcr3*^Mendel的发现为这一目标提供了重要的基因资源，同时展示了基因组测序和分子标记技术在抗病基因定位中的强大功能。

未来的研究可以进一步探讨*Rcr3*^Mendel的分子机制，例如其如何识别病原体、如何激活免疫反应，以及是否存在与其他抗性基因的协同作用。此外，研究团队还建议进行更广泛的田间试验，以验证该基因在实际种植环境中的表现。通过这些研究，有望开发出更加稳定和高效的抗病品种，从而减少根肿病对油菜产量的影响。

### 9. 技术方法的创新与应用

本研究采用了多种先进的分子生物学技术，包括GBS和KASP，这些技术在作物基因组研究中具有广泛的应用前景。GBS是一种高通量的基因分型方法，能够快速检测SNP变异，为抗性基因的定位提供大量数据支持。而KASP则是一种高精度的分子标记技术，能够用于验证和精确定位特定基因。

此外，研究团队还利用了*B. napus*参考基因组‘ZS11’进行SNP比对和基因定位，这一参考基因组的建立为后续研究提供了重要的基础。通过将这些技术与传统遗传分析相结合，研究团队不仅成功定位了*Rcr3*^Mendel，还为未来的研究提供了技术框架和方法论支持。

### 10. 研究的局限性与进一步研究方向

尽管本研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性。例如，由于DH群体的构建方式，某些基因可能未被充分检测到，特别是在标记密度较低的区域。此外，由于抗性基因可能受到多种因素的影响，如环境条件、基因表达水平和基因互作，因此需要进一步的实验来验证其功能。

未来的研究可以考虑使用更大的DH群体，以提高基因定位的准确性。同时，结合功能基因组学和蛋白质组学技术，可以更深入地了解*Rcr3*^Mendel的分子机制。此外，研究团队还建议对其他可能的抗性基因进行系统分析，以揭示其在不同病原体变种中的作用。这些研究将有助于构建更加全面的抗病基因库，为油菜抗病育种提供坚实的理论基础和实践指导。

综上所述，本研究不仅揭示了油菜品种“Mendel”中抗根肿病基因*Rcr3*^Mendel的遗传定位，还为抗病基因的进一步研究和应用提供了重要的线索。随着分子生物学技术的不断进步，未来有望开发出更加高效和稳定的抗病油菜品种，从而保障全球油菜种植业的可持续发展。