利用现场解吸质谱法确定食腐昆虫蛹壳的物种身份

《Forensic Chemistry》：Determination of the species identity of necrophagous insect puparial casings using field desorption mass spectrometry

本研究利用场解吸-质谱技术（FD-MS）结合多元统计分析，成功鉴别了6种吹蝇（Calliphoridae）的蛹壳，检测到高分子量烷烃（C55）、甾醇（C58）等化合物，为复杂环境下的物种鉴定提供新方法。

　　在死亡调查中，确定死亡时间（也称为死后间隔，PMI）是一项关键任务。对于在死亡后72小时内发现的遗体，通常采用的方法包括测量尸体温度、观察尸斑或尸僵现象，以及分析眼球玻璃体中的盐化学成分。然而，当遗体经历高度分解、被野生动物取食或受到各种环境条件的影响时，这些方法可能不再适用。在这种情况下，法医昆虫学家可以通过分析在遗体上繁殖的节肢动物来估算死亡时间。这些昆虫不仅能够揭示死亡的时间，还能提供关于死亡环境的其他信息，例如尸体是否被移动，或者死者是否接触过药物或毒素。某些昆虫，如丽蝇科的腐尸食性种类，能够在死亡后几分钟到几小时内检测到遗体，并且可以从距离遗体2公里远的地方飞来。因此，这些昆虫在法医昆虫学研究中具有重要价值。

死亡后，雌性成虫会在遗体上产卵，卵孵化后成为幼虫（蛆），它们以遗体为食并经历第一、第二和第三幼虫阶段。这些幼虫阶段的昆虫通常被发现并提取。然而，在第三幼虫阶段，幼虫可能会离开遗体寻找合适的地点化蛹。化蛹后，成虫从蛹室中羽化，留下空的蛹室。如果假设这些卵是在死亡后几分钟到几小时内产下的，那么提取的昆虫证据的年龄可以反映死亡后的时间，从而提供PMI的估算。然而，由于成虫具有较强的扩散能力，它们通常不会在遗体被发现或受到干扰时被收集。此外，许多昆虫可能被遗体吸引，因此，法医昆虫学家更关注的是昆虫的繁殖事件及其产生的幼虫，而不是成虫本身。

因此，最常见的昆虫证据包括卵、幼虫和蛹。为了准确判断这些昆虫的年龄，通常需要对其物种进行准确鉴定。因为不同物种在不同发育阶段所需的时间不同，且受到环境因素如温度和湿度的影响，物种鉴定对于年龄估算至关重要。一种常用的方法是将样本培养至成虫阶段，根据羽化所需的时间来判断死亡时间。然而，这种方法在样本不可行（即样本已经死亡）时无法使用。另一种方法是DNA分析，但在提取的基因组材料高度降解或相关物种在样本中未被充分代表时，这种方法可能不可行。基因表达分析虽然已被提出，但需要完整的mRNA样本，这在许多情况下难以实现。此外，由于DNA在长时间暴露后容易降解，其扩增和测序可能不再是一个可行的选择。

因此，为了应对非存活样本的年龄估算问题，研究者们开发了替代方法。其中，昆虫表皮的化学成分，特别是其化学指纹，被认为是一个有前景的途径。昆虫表皮化学成分（CHC）的特征包括物种、发育阶段、地理来源和年龄的特异性。这些化学成分主要由饱和和不饱和的碳氢化合物、蜡、酰基甘油、磷脂和糖脂组成。尽管CHC分析具有潜力，但在遗体高度腐烂的情况下，卵、幼虫和蛹可能已经不存在，因此，仅剩的证据可能是蛹室。蛹室是一种坚固且持久的结构，即使在各种环境条件下也能存活数月甚至数年。此外，蛹室也表现出物种和年龄特异性的CHC特征，这使得它们成为法医昆虫学研究的重要对象。然而，由于成虫羽化后会破坏这些物理特征，因此在蛹室中保留的化学信息成为物种鉴定的关键依据。

目前，大多数CHC分析是通过气相色谱-质谱联用技术（GC–MS）进行的。这种方法依赖于有机溶剂（如戊烷、己烷、氯仿或二氯甲烷）提取蛹室中的化学成分，并通过色谱分离后进行质谱分析。研究表明，这些化学指纹可以通过统计建模方法进行分析，从而提供物种识别的信息。此外，即使蛹室经历了长时间的风化过程，其CHC特征仍可能保持诊断价值。例如，Zhu等人发现，腐尸食性蝇类*Chrysomya rufifacies*的蛹室CHC特征具有高度的可预测性，可用于估算长期PMI。然而，其他研究指出，严重的风化可能会显著改变化学成分，从而降低基于实验室条件获得的化学特征构建的数学预测模型的准确性。

通常，GC–MS分析能够检测到碳链长度在17至35之间的碳氢化合物。然而，可能存在一些对风化具有更高抗性的化学成分，这些成分可能存在于样本中，但由于其非挥发性而无法通过GC–MS检测到。这一假设得到了支持，因为一项研究表明，通过基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）分析昆虫CHC时，可以检测到含有超过70个碳原子的高分子量碳氢化合物，而这些成分在GC–MS的色谱图中并未出现。例如，对腐尸食性蝇类*Sarcophaga bullata*的MALDI-MS分析显示，其CHC范围从36到50个碳原子，并且含有0到4个不饱和位点。这些成分在GC–MS分析中未被观察到，表明存在一些未被传统方法检测到的化学成分。

相比之下，FD-MS（场致蒸发质谱）作为一种更易于获取的质谱技术，能够揭示蛹室中更广泛的化学成分。FD-MS的离子化过程相较于GC–MS中的电子轰击离子化更为温和，能够更有效地检测未被碎片化的前体离子。因此，FD-MS能够揭示一些在GC–MS中难以检测的高分子量化合物。这种技术的一个重要优势是，它不需要与色谱联用，因此可以快速分析样本，大约只需1.5分钟即可完成一次分析。此外，FD-MS能够检测到大分子量的饱和或不饱和碳氢化合物，以及甾醇和酯类化合物，这些成分在风化过程中可能更加稳定。

通过FD-MS分析六种丽蝇科物种的蛹室，研究者们成功实现了100%的物种识别准确率。研究中使用了六种常见的丽蝇科物种：*Calliphora latifrons*、*C. livida*、*C. vicina*、*Lucilia cuprina*、*L. sericata*和*Phormia regina*。分析结果显示，FD-MS能够检测到与这些物种相关的多个高分子量化合物，包括含有高达55个碳原子的烷烃，以及含有高达58个碳原子和两个氧原子的甾醇和酯类化合物。这些化合物在文献中尚未被广泛报道，表明FD-MS能够揭示一些独特的化学特征。

此外，研究还发现了一些特定于某些物种的化合物，例如3-甲基三十三烷（*C. vicina*）、11,11-二甲基二十五烷（*C. latifrons*）、2-甲基三十六烷（*C. livida*）和11-癸基三十二烷（*L. sericata*）。这些化合物在FD-MS分析中被检测到，但在GC–MS中无法观察到，表明FD-MS能够揭示一些在传统方法中被忽略的化学成分。这些成分的存在可能为统计模型提供更多的区分信息，从而提高物种鉴定的准确性，尤其是在样本经历显著风化的情况下。

在本研究中，FD-MS分析应用于六种丽蝇科物种的己烷提取物。通过多变量统计分析方法处理数据，研究者们能够实现所有物种的100%准确识别。分析结果还表明，FD-MS能够检测到一些在GC–MS中无法观察到的高分子量化合物，这些化合物可能对物种区分具有重要价值。由于这些化合物具有更高的分子量，它们可能在风化过程中更不容易蒸发，从而保持其化学特征的完整性。因此，FD-MS不仅能够提供快速的分析结果，还能在样本经历显著风化的情况下，保留更高的化学信息完整性。

综上所述，FD-MS作为一种新的快速分析技术，能够有效解决传统方法在检测非挥发性化合物方面的局限性。通过揭示蛹室中更广泛的化学成分，特别是那些在风化过程中更稳定的高分子量化合物，FD-MS为法医昆虫学研究提供了新的工具。这种方法不仅提高了物种鉴定的准确性，还为估算死亡时间提供了更可靠的数据支持。未来，FD-MS可能在法医昆虫学领域得到更广泛的应用，特别是在处理高度风化的样本时，其优势将更加明显。