《Fish & Shellfish Immunology》：Assessment of Immune and Pro-Apoptotic Functions of Mitogen-activated Protein Kinase-Interacting Kinase 2 (MKNK2) in Yellowtail Clownfish (
Amphiprion clarkii)
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本研究通过生物信息学分析及功能实验，揭示了黄尾小丑鱼MKNK2基因（AcMKNK2）的结构特征、组织特异性表达及在氧化应激和免疫调节中的作用，明确了其通过调控凋亡和炎症通路介导宿主免疫反应的分子机制。
H.A.C.R. Hanchapola|D.S. Liyanage|W.K.M. Omeka|Yasara Kavindi Kodagoda|M.A.H. Dilshan|D.C.G. Rodrigo|G.A.N.P. Ganepola|B.P.M. Vileka Jayamali|Gaeun Kim|Jeongeun Kim|Qiang Wan|Jihun Lee|Jehee Lee
韩国济州国立大学海洋生命科学系及基因组选择研究中心，济州63243，大韩民国
摘要
丝裂原活化蛋白激酶相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2（MKNK2）通过磷酸化真核生物起始因子4E（eIF4E）来调节蛋白质合成。在本研究中，我们利用不同的功能检测方法，对黄尾小丑鱼（Amphiprion clarkii）的MKNK2基因（AcMKNK2）进行了转录反应和功能特性的分析。AcMKNK2基因包含一个1,425个碱基对的开放阅读框，编码467个氨基酸。该蛋白的预测分子量为53.25 kDa，等电点值为6.10。在AcMKNK2的氨基酸序列中发现了两个保守的活性基序（210ENIL213和229DLG231）以及一个蛋白激酶ATP结合位点。在正常生理条件下，AcMKNK2在肌肉组织中的表达最高；而在多聚肌苷酸（poly(I:C)）、脂多糖（LPS）和Vibrio harveyi的刺激下，其在血液、鳃和头肾组织中的表达显著上调。亚细胞定位分析显示AcMKNK2蛋白定位于细胞核中。此外，过表达AcMKNK2会增加脂肪头鲦鱼细胞在H2O2作用下的活性氧生成以及Bax/Bcl-2 mRNA的表达比例，这表明其在氧化应激条件下具有促凋亡活性。另外，过表达AcMKNK2的RAW267.4细胞在LPS刺激后表现出M1标记基因表达和NO生成的显著增加。总体而言，这些发现表明AcMKNK2通过驱动促凋亡途径和增强促炎机制来调节黄尾小丑鱼的细胞应激反应和宿主免疫。
引言
丝裂原活化蛋白激酶相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2（MKNK2）通过磷酸化真核生物起始因子4E（eIF4E）在转录后调控中起关键作用，从而促进特定mRNA的翻译。这种调控机制对于响应多种细胞刺激控制基因表达和蛋白质合成至关重要[1]。MKNK2在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导级联反应的更广泛背景下发挥作用[2][3]，并在生长因子、细胞因子和环境压力刺激下通过细胞外信号调节激酶（ERK1/2）和p38 MAPKs的磷酸化而被激活[4]。通过这种依赖于磷酸化的翻译调控，MKNK2优先增强免疫相关蛋白（如细胞因子、趋化因子和抗菌肽）的合成，从而在感染期间协调宿主防御机制并维持细胞稳态[5]。此外，MKNK2通过调节促炎型M1和抗炎型M2表型之间的平衡来影响巨噬细胞的极化。这是通过依赖于磷酸化的细胞因子翻译和效应功能调控实现的。这一调控轴在炎症、肿瘤进展和组织修复过程中对巨噬细胞介导的免疫反应起着关键作用[6][7][8][9]。此外，MKNK2还与其他关键信号通路（包括雷帕霉素（mTOR）和PI3K/AKT通路）相互作用，突显了其在细胞适应、代谢和应激反应中的广泛参与[10]。
在生物体水平上，基因组分析显示MKNK2在脊椎动物中具有进化保守性，其催化结构域的同源性尤其高[11]。转录组数据进一步表明其在大脑、骨骼肌和免疫细胞中的表达普遍存在，表明其在神经系统和免疫系统中的功能重要性[12]。在水生脊椎动物中，包括硬骨鱼类，MKNK2参与了胚胎发育和器官发生的调控，通过调节形态发生和环境响应因子的翻译[13]。有趣的是，MKNK2的表达模式也与水生生物的关键生理转变相关，为它们的生态适应性提供了分子层面的见解[14]。先前的关于硬骨鱼类MKNK2的研究主要将其与环境压力联系起来，包括珍珠石斑鱼（Epinephelus lanceolatus）的低温暴露[15]、黑岩鱼（Sebastes schlegelii）的缺氧[16]、金头鲷（Sparus aurata）的季节性和温度变化[17]以及红树林 killifish（Kryptolebias marmoratus）的温度依赖性信号传导[18]。尽管有这些发现，其在鱼类中的免疫和凋亡功能仍待探索。为填补这一空白，本研究重点研究了Amphiprion clarkii中的MKNK2（AcMKNK2），探讨其在免疫调节和凋亡中的潜在作用。
Amphiprion clarkii是一种广泛养殖的海葵鱼，原产于印度-太平洋海域，以其醒目的色彩和在珊瑚礁系统中的生态重要性而闻名[19]。与许多海洋观赏物种类似，A. clarkii容易受到水质波动、病原体暴露和温度变化等环境压力的影响，这些因素会损害其免疫功能和整体健康。在本研究中，我们通过计算机模拟（in silico）方法分析了AcMKNK2的特征及其组织特异性表达，并探讨了其可能的免疫调节和凋亡作用，认为其促凋亡活性与氧化应激信号传导有关。总体而言，这些发现为理解MKNK2在硬骨鱼类中的免疫生理学意义提供了机制上的见解。
计算机模拟分析
计算机模拟分析
我们从一个现有的黄尾小丑鱼转录组数据集中获得了完整的AcMKN2 cDNA序列[20]。使用了多种计算机模拟分析和软件来表征AcMKNK2基因。首先，利用国家生物技术信息中心（NCBI）数据库（
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ）确认了AcMKNK2序列。随后，使用ExPASy Prosite[21]和NCBI保守结构域数据库（CDD）[22]来识别其功能特征
MKNK2序列的计算机模拟分析
AcMKNK2核苷酸序列被提交到NCBI GenBank，登录号为PV138239。该开放阅读框包含1,425个碱基对，编码467个氨基酸，计算分子量为53.25 kDa，理论等电点为6.10 pI。使用SignalP的分析未检测到信号肽。NCBI CDD搜索显示，在残基85到385之间存在一个保守的MKNK2结构域，其中包括特征性的“229DLG231”和“210ENIL213”活性基序（见补充图1和2）。讨论
MAPK家族蛋白是多种细胞过程中的核心信号枢纽，包括细胞分裂、应激反应和炎症[31]。作为MAPK信号传导的下游效应器，MKNK2磷酸化对细胞增殖、分化和生存至关重要的各种底物[4]。在MKNK2蛋白序列中，存在一个在不同物种中保守的DLG（Asp-Leu-Gly）基序，该基序参与激酶活性、信号通路和蛋白质-蛋白质相互作用
作者贡献声明
1. H.A.C.R. Hanchapola ：概念构思、方法设计、实验实施、初稿撰写。
2. D.S. Liyanage
3. W.K.M. Omeka
4. Yasara Kavindi Kodagoda
5. M.A.H. Dilshan
6. D.C.G. Rodrigo
7. G.A.N.P. Ganepola
8. B.P.M. Vileka Jayamali
9. Gaeun Kim 致谢
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究计划的支持，该计划由教育部资助（RS-2019-NR040078），以及由海洋渔业部资助的韩国海洋科学技术促进院（KIMST）的支持（RS-2022-KS221670）。
