对黑岩鱼（Sebastes schlegelii）感染沙门氏菌（Aeromonas salmonicida）反应的lncRNA-mRNA网络的全面分析

《Comparative Immunology Reports》：Comprehensive analysis lncRNA-mRNA networks in black rockfish ( Sebastes schlegelii) response to Aeromonas salmonicida infection

黑岩鱼感染鲑鱼弧菌后肝脏lncRNA表达谱及功能分析。通过RNA测序鉴定6204个lncRNA，筛选出739个差异表达lncRNA，发现其与32,158个共表达和47,244个共定位mRNA形成调控网络。GO和KEGG分析表明，靶基因涉及PPAR信号通路、急性期反应、氧化还原平衡等免疫相关过程，提示lncRNA通过调控代谢和信号通路参与黑岩鱼免疫应答。qRT-PCR验证了部分lncRNA和mRNA的表达趋势一致性。

　　本研究聚焦于一种重要的海洋养殖鱼类——黑岩鱼（*Sebastes schlegelii*）在感染*Aeromonas salmonicida*（一种革兰氏阴性细菌）后的长链非编码RNA（lncRNA）表达变化及其在免疫调节中的作用。*A. salmonicida*是一种广泛分布于海水和淡水环境中的病原体，能够引发多种鱼类的感染症状，如皮肤溃疡、出血等，对全球主要水产养殖区造成严重的经济损失。在中国北方，尤其是烟台地区，黑岩鱼养殖业曾因*A. salmonicida*的感染而导致大量鱼群死亡，给养殖业带来显著的经济损失。目前，针对该病原体尚无特别有效的治疗和预防手段，尽管在鲑科鱼类中，细菌疫苗已被证明具有一定的效果，但其在非鲑科鱼类中的应用效果仍不明确。因此，深入研究lncRNA在鱼类免疫反应中的作用，不仅有助于揭示免疫调控的分子机制，也为提高养殖效益和推动相关研究提供了理论支持。

lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，因其缺乏蛋白质编码能力而被定义为非蛋白编码转录本。尽管lncRNA不直接编码蛋白质，但它们在多种生物学过程中发挥着重要作用，包括转录调控、核结构组织、蛋白质或RNA活动的调节等。根据其在染色体上与蛋白编码基因的位置关系，lncRNA可分为五种类型：基因间lncRNA（lincRNA）、内含子lncRNA、顺式lncRNA、反式lncRNA和双向lncRNA。基因间lncRNA通常位于蛋白编码基因之间，独立于邻近基因的启动子区域进行表达。内含子lncRNA则完全包含在蛋白编码基因的内含子中，不与外显子区域重叠。顺式lncRNA与相邻的蛋白编码基因在同一条DNA链上转录，可能与外显子或内含子重叠。反式lncRNA则来源于与蛋白编码基因互补的DNA链，通过序列特异性相互作用调节基因表达。双向lncRNA则在距离蛋白编码基因启动子不足1 kb的位置开始转录，但方向相反，共享启动子元件。此外，lncRNA还参与调控多种生理和生物学过程，包括正常生理状态、疾病状态以及免疫反应等。

鱼类作为最古老的脊椎动物群体，拥有先天性和适应性免疫系统。已有研究表明，lncRNA在多种鱼类中广泛存在，并参与肝脏代谢、生长发育以及对多种应激因素（如网具捕捞、追逐、缺氧、细菌和病毒感染）的免疫反应。例如，Bolta?a等人比较了大西洋鲑鱼在健康组和感染传染性鲑鱼贫血病毒（ISAV）组的lncRNA表达谱，发现大多数假定的lncRNA对ISAV感染具有响应性，其靶基因主要与先天免疫和抗原呈递过程相关。而在虹鳟鱼中，556个lncRNA在感染*Flavobacterium psychrophilus*后表现出差异表达，这些lncRNA主要富集在免疫相关通路，如TNF和mTOR信号通路，以及与微生物感染相关的通路，如*Staphylococcus aureus*感染和病毒致癌。此外，Xiu等人在感染*Edwardsiella tarda*的橄榄鲈鱼肠道中发现了115个差异表达的lncRNA，其靶基因主要参与免疫反应及相关信号通路，如MAPK信号通路、细胞外基质-受体相互作用和吞噬体等。这些研究表明，lncRNA在鱼类免疫应答中具有重要的调控作用，但其具体机制仍有待进一步阐明。

黑岩鱼作为一种在中国黄海和渤海地区具有重要经济价值的养殖鱼类，其养殖过程中面临着细菌和病毒感染带来的挑战，如生长速率下降、抗病能力减弱和死亡率上升等。因此，本研究旨在通过转录组测序技术，分析黑岩鱼肝脏在*A. salmonicida*感染后的lncRNA表达情况，探索其在免疫调控中的作用。研究采用Illumina HiSeq 4000平台进行高通量测序，获取了高质量的转录组数据，并通过差异表达分析、共表达和共定位分析，预测了lncRNA与mRNA之间的潜在调控关系。此外，通过GO富集分析和KEGG通路分析，进一步揭示了这些lncRNA靶基因在免疫相关通路中的功能。最后，通过qRT-PCR验证了部分lncRNA和mRNA的表达模式，确保了转录组数据的准确性。

研究结果显示，共鉴定出6,204个lncRNA，其中739个表现出显著的表达变化。在感染后2小时、12小时和24小时，分别有18个、298个和201个lncRNA呈现上调表达，而下调表达的lncRNA数量则相对较少。这一结果表明，感染后lncRNA的表达模式发生了显著变化，且上调的lncRNA数量略高于下调的lncRNA。同时，通过共表达和共定位分析，共预测了32,158个lncRNA-mRNA共表达对和47,244个共定位对。其中，3,247个lncRNA为反式调控，2,491个为顺式调控，且大多数lncRNA位于mRNA的上下游区域。这些结果提示，lncRNA在感染过程中可能通过多种方式与mRNA相互作用，从而调控基因表达。

GO富集分析和KEGG通路分析进一步揭示了这些差异表达mRNA的功能。在感染后2小时，主要富集的GO项包括磷酸化、脂质反应、细胞对脂质的反应以及对有机环状化合物的反应，表明早期信号级联反应或代谢适应的激活。磷酸化是一种通过可逆的蛋白磷酸化和去磷酸化调控活性的重要机制，脂质信号则可能用于调整膜动态和次级信使系统以应对压力。对有机环状化合物的反应可能涉及特殊代谢物的参与，这些代谢物可能用于中和反应性中间产物或作为跨膜通讯的信号。在感染后12小时，蛋白质和细胞定位的富集提示了结构重塑，这一阶段可能涉及关键蛋白的重新定位以优化细胞功能。适当的蛋白定位对于维持细胞稳态至关重要，而错误的定位可能导致受体信号异常或酶活性干扰。例如，红ox敏感的转录因子需要核转位以激活抗氧化基因，而膜结合的转运蛋白可能重新定位以增强代谢物的摄入或排出。在感染后24小时，氧化还原过程的富集反映了晚期代谢变化，以恢复氧化还原平衡。活性氧（ROS）作为信号分子，可能在感染后期积累到有害水平，而谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白等酶则通过硫醇-二硫键交换反应缓解氧化损伤。这一阶段还涉及修复氧化的大分子和回收氧化还原缓冲液如谷胱甘肽（GSH），以恢复氧化还原稳态。此外，在感染后2小时，粗面内质网膜、粗面内质网和cis-高尔基网络的富集表明，分泌途径在早期应激适应中具有重要作用。随着感染时间的推移，这些富集的通路逐渐发生变化，可能反映了细胞对压力的适应过程。

KEGG通路分析进一步揭示了感染过程中不同阶段的生物学反应。在感染后2小时，PPAR信号通路和脂肪细胞因子信号通路的显著富集表明，代谢调控在早期阶段被激活。PPAR信号通路作为调控脂质代谢和能量稳态的主要途径，可能通过启动脂肪酸氧化的转录程序响应急性应激细胞。同时，脂肪细胞因子通路整合了胰岛素敏感性和炎症反应，可能在早期阶段协调代谢适应与免疫调控之间的相互作用。在感染后的12至24小时，关键通路向吞噬体、凋亡、溶酶体和内质网蛋白处理方向转移，表明细胞正在经历结构重塑和压力缓解。持续激活的吞噬体-溶酶体系统可能意味着对受损细胞器或病原体的增强降解，而上调的蛋白分泌和内质网处理通路则可能反映了对分泌蛋白合成和质量控制的需求增加。凋亡信号的出现进一步表明，细胞正在通过程序化清除机制回收细胞质成分和细胞器，这与长期压力适应相一致。

此外，本研究构建了lncRNA-mRNA调控网络，揭示了感染过程中差异表达的lncRNA与其靶基因之间的动态相互作用。研究发现，14个核心mRNA在所有时间点均被检测到，表明它们在协调宿主反应中起着关键作用。例如，PEPCK（Chr1.1245）是一种与糖异生相关的基因，而CYP27B1（Chr1.2059）则是一种调控维生素D代谢的关键基因，提示感染可能引发代谢重编程和免疫调节。LPIN1（Chr2.866）和ADCY1（Chr4.969）分别作为脂质代谢和cAMP信号的调节因子，可能在炎症或抗病反应中发挥作用。CREM（Chr13.414）可能调控T细胞激活和细胞因子（如IL-2）的产生，进而影响免疫耐受和自身免疫反应。SIK2则通过代谢通路（如AMPK信号）调控巨噬细胞极化和炎症反应。这些靶基因分布在12条染色体上，表明lncRNA在基因表达调控中的广谱能力，这与它们作为广泛调控因子的特性一致。

本研究还通过qRT-PCR验证了部分lncRNA和mRNA的表达模式，结果表明这些基因的表达趋势与转录组数据基本一致。例如，PEPCK（Chr1.1245）和TCONS_00046558的表达在感染后12小时达到峰值，并在24小时后下降。这一趋势进一步支持了lncRNA在感染过程中的动态调控作用。同时，某些lncRNA表现出相反的表达趋势，如TCONS_00123000在感染后逐步下调，而TCONS_00097290则显著上调，提示它们在感染不同阶段可能具有不同的调控功能。这些动态变化可能反映了宿主在感染过程中为平衡免疫激活和代谢保存而采取的适应性策略。

综上所述，本研究揭示了lncRNA在黑岩鱼肝脏感染*A. salmonicida*后的表达变化及其在免疫调控中的作用。研究结果不仅为理解lncRNA在鱼类免疫反应中的功能提供了新的视角，也为进一步研究lncRNA在鱼类病原体感染中的作用奠定了基础。未来的研究需要通过更多的实验室实验和功能验证来确认这些结果，以期更全面地揭示lncRNA在免疫调控中的分子机制。