壳聚糖/β-葡聚糖纳米颗粒包裹的灭活无乳链球菌口服疫苗对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的免疫原性和保护效果

《Comparative Immunology Reports》：Immunogenicity and protective efficacy of chitosan/β-glucan nanoparticle encapsulated inactivated Streptococcus agalactiae oral vaccine for Nile tilapia ( Oreochromis niloticus)

本研究开发了一种壳聚糖/β-葡聚糖纳米颗粒（Cs/β-g）载体口服疫苗，用于尼罗 tilapia（Oreochromis niloticus）的抗Streptococcus agalactiae疫苗。通过包被正式灭活疫苗于Cs/β-g纳米颗粒中，经饲料给药，评估其免疫效果。实验显示，G4组（纳米颗粒+疫苗）在28天后的溶菌酶、髓过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性均显著高于对照组（G1），IgM抗体水平在14和28天时也显著提升。挑战实验中，G4组存活率达75.56%，显著高于其他组（G1 33.33%，G2 51.11%，G3 62.22%）。病理学分析证实疫苗有效减少组织损伤。该研究证实Cs/β-g纳米颗粒作为口服疫苗载体可显著激活宿主先天和适应性免疫反应，为水产疫苗开发提供新方案。

　　在近年来，随着全球对水产养殖业的依赖日益增加，尼罗罗非鱼（*Oreochromis niloticus*）作为一种重要的经济鱼类，其养殖过程中频繁出现的疾病爆发，尤其是由B组链球菌（*Streptococcus agalactiae*）引起的高死亡率，对养殖业的经济收益构成了重大威胁。此外，这些疾病还与抗生素耐药性（AMR）的加剧密切相关，而抗生素的过度使用不仅污染了水体，也促进了病原体对抗生素的耐药性发展。因此，寻找一种可持续且有效的疾病防控手段，尤其是疫苗的研发与应用，成为了当前水产养殖领域的重要研究方向。

疫苗作为一种有效的防控手段，能够显著降低疾病对鱼类的威胁，特别是在应对细菌感染方面。与传统的注射疫苗（i.p.）或浸没式疫苗（i.m.）相比，口服疫苗因其非侵入性、低应激和成本效益而成为一种更受关注的替代方案。然而，口服疫苗在鱼类中的应用仍面临诸多挑战，主要在于抗原在消化系统中的稳定性以及其是否能够有效激活免疫系统。为了解决这些问题，研究者们开始探索使用新型的纳米载体来增强疫苗的稳定性和免疫效力。其中，壳聚糖（chitosan）与β-葡聚糖（β-glucan）复合纳米颗粒因其良好的生物相容性、黏附性和免疫增强特性，被认为是一种极具潜力的疫苗载体。

本研究旨在评估一种由壳聚糖/β-葡聚糖纳米载体封装的灭活疫苗通过口服途径在尼罗罗非鱼体内对*Streptococcus agalactiae*感染的保护效果。通过将灭活的B组链球菌抗原与壳聚糖/β-葡聚糖纳米颗粒结合，并将其负载到商业饲料中，研究团队希望探索这种新型疫苗在提高鱼类免疫应答方面的潜力。该疫苗的制备过程包括对细菌进行甲醛灭活，并通过纳米颗粒封装技术确保其在胃肠道中的稳定性，从而有效避免抗原的降解，提高免疫效果。

为了验证疫苗的有效性，研究团队对不同处理组的鱼类进行了免疫应答评估。通过血清学和组织学方法，他们检测了多个免疫指标，包括溶菌酶活性、髓过氧化物酶活性、抗蛋白酶活性、超氧化物歧化酶活性以及IgM抗体水平。这些指标反映了鱼类的先天免疫系统和适应性免疫系统对疫苗的反应情况。此外，研究团队还通过RT-qPCR技术检测了脾脏中的免疫相关基因表达，以进一步了解疫苗对鱼类免疫系统的影响。在挑战实验中，研究人员将不同处理组的鱼类暴露于*Streptococcus agalactiae*的致死剂量（LD50），并计算了相对存活率（RPS）以评估疫苗的保护效果。

在实验设计中，300条健康的尼罗罗非鱼被随机分为四个处理组，分别接受不同的处理方式。其中包括对照组（仅喂养商业饲料），正对照组（喂养负载了灭活疫苗的商业饲料），仅使用纳米颗粒组（喂养负载了纳米颗粒的饲料），以及负载了灭活疫苗的纳米颗粒组（G4）。所有鱼类在实验开始前均经过14天的适应期，以确保其在实验条件下的健康状态。在最初的7天，所有处理组均被喂养带有疫苗的饲料，随后7天喂养非疫苗饲料，最后7天再次喂养带有疫苗的饲料作为加强剂量。在疫苗接种后的第1、2、3、4周，研究团队采集了鱼类的血液样本，以检测其免疫应答的变化。在第30天，所有处理组的鱼类均接受了*Streptococcus agalactiae*的挑战，并在随后的15天内记录其存活情况。

研究结果显示，使用壳聚糖/β-葡聚糖纳米载体封装的灭活疫苗（G4）在提高尼罗罗非鱼的存活率方面表现出显著优势。在挑战实验中，G4组的相对存活率达到了75.56%，远高于其他组别。这一结果表明，这种纳米载体不仅能够有效保护抗原免受胃酸和消化酶的破坏，还能增强鱼类的免疫应答，包括先天免疫和适应性免疫。此外，免疫相关基因的表达分析进一步支持了这一结论，表明G4组在14天和28天后，多个关键免疫基因的表达水平均显著上升，显示出疫苗在激活免疫系统方面的强大能力。

从免疫学角度来看，溶菌酶活性、髓过氧化物酶活性、抗蛋白酶活性和超氧化物歧化酶活性均是评估鱼类免疫应答的重要指标。这些指标的变化不仅反映了鱼类在疫苗接种后的免疫系统反应，还揭示了纳米载体在提高这些免疫参数方面的作用。例如，G4组的溶菌酶活性在所有时间点均显著高于其他组，说明其能够更有效地清除病原体。同样，髓过氧化物酶活性的增加也表明鱼类在面对感染时具有更强的防御能力。此外，超氧化物歧化酶活性的提升则进一步说明疫苗有助于减轻氧化应激对鱼类造成的伤害。

IgM抗体水平的检测则提供了关于适应性免疫应答的直接证据。IgM是鱼类体液免疫系统中的关键组成部分，通常在疫苗接种后首先产生，用于中和病原体并促进其清除。在本研究中，G4组的IgM水平在14天和28天后均显著高于对照组，表明该疫苗能够有效刺激鱼类产生针对*Streptococcus agalactiae*的特异性抗体。这一结果不仅证明了疫苗的有效性，还表明壳聚糖/β-葡聚糖纳米载体在提高抗原递送效率和免疫应答强度方面具有重要作用。

从病理学角度来看，组织学分析进一步验证了疫苗的保护效果。在感染后15天，研究人员对肾脏、脑和脾脏进行了组织切片和染色分析。结果显示，G4组的组织损伤明显减轻，炎症反应和出血现象显著减少，而对照组（G1）则表现出严重的组织病变。这些组织学变化表明，疫苗不仅能够增强鱼类的免疫能力，还能在实际感染条件下提供有效的保护。

本研究的意义在于，它为水产养殖业提供了一种新型的疫苗递送系统，该系统基于壳聚糖和β-葡聚糖的复合纳米颗粒，能够有效提高疫苗的稳定性和免疫效力。与传统的疫苗递送方式相比，这种纳米载体不仅降低了对鱼类的应激，还减少了抗生素的使用，从而有助于缓解抗生素耐药性问题。此外，这种递送方式的简便性和可扩展性，使其在大规模水产养殖中具有广阔的应用前景。

综上所述，本研究展示了壳聚糖/β-葡聚糖纳米载体在口服疫苗递送中的巨大潜力。通过系统的免疫学评估和病理学分析，研究团队确认了这种纳米载体在增强鱼类免疫应答、提高疫苗效力和减少疾病影响方面的有效性。这些发现不仅为水产养殖业提供了新的疾病防控策略，也为未来开发更加安全、高效的疫苗奠定了基础。