胶质母细胞瘤力学中的维度记忆：二维与三维胶原环境下培养细胞的牵引力分析

本研究针对胶质母细胞瘤(GB)体外模型难以准确复制体内肿瘤细胞特性的挑战，创新性地通过牵引力显微镜(TFM)技术，对比分析了LN229、T98G人GB细胞系及HMC3人小胶质细胞系在二维(2D)胶原涂层表面和三维(3D)胶原生物活性基质中培养后的力学行为。研究发现GB细胞在2D环境下产生显著更高的牵引应力，揭示了胶原支架等蛋白基生物活性材料在模拟体内肿瘤微环境研究中的重要性，强调了互补生物物理检测和现实3D生物活性基质在GB力学研究中的关键价值。

　　

在恶性脑肿瘤领域，胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GB)始终是最具侵袭性和致命性的类型，被归类为IV级星形细胞瘤。尽管通过手术、放疗和化疗等多种治疗手段进行干预，患者的预后情况依然不容乐观，中位生存期通常不足15个月，高达90%的复发率更是凸显了开发更好疗法和可靠临床前模型的迫切需求。长期以来，对GB的研究多集中于分子和遗传视角，但近年来，人们越来越关注其肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)，包括其中的机械和结构线索。TME在神经胶质瘤的进展、耐药和侵袭过程中扮演着关键角色。

GB细胞与微环境中的细胞和非细胞成分发生动态相互作用，通过感知机械线索并做出反应，引发细胞骨架重塑、力生成和形态变化。细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)是这一相互作用中的关键参与者，它不仅提供结构支持，更主动地塑造着肿瘤行为。在GB中，胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白和透明质酸等ECM成分影响着细胞粘附、迁移和侵袭。粘附位点、营养梯度化和生化信号共同促进了动态的结构重塑，进一步强化了GB的高度侵袭表型。

然而，在体外剖析这些机械生物学过程本身也面临着挑战。传统的GB研究广泛依赖体内系统和二维(2D)细胞培养系统。虽然体内模型（尤其是啮齿类动物）能提供生物学背景，但物种间的差异往往限制了其临床转化价值。相反，在2D表面上培养细胞虽然能够进行高度可控的实验，但却缺乏大脑天然三维(3D)微环境的机械和拓扑复杂性。在刚性2D塑料表面上生长的细胞会呈现扁平化形态，与3D环境相比，其基因表达、细胞骨架组织和信号活性都会发生改变。这些局限性促使研究转向能更好复制体内样条件的3D生物仿生培养系统。

在ECM成分中，I型胶原因其可调节的机械性能和生物学相关性，被广泛应用于2D和3D的GB模型。通过调节胶原浓度或酶促交联，研究人员可以模拟脑组织的不同刚度水平。研究表明，与高浓度水凝胶(10 mg/mL)相比，GB细胞在低浓度胶原水凝胶(3–5 mg/mL)中表现出增强的细胞运动性，这使得这些模型在研究侵袭力学方面具有生理相关性。

基于胶原的2D和3D培养模型，评估先前的维度背景如何影响胶质母细胞瘤细胞的生物力学行为变得至关重要。为此，研究团队采用了牵引力显微镜(Traction Force Microscopy, TFM)这一广泛应用的技术，通过追踪柔性、ECM包被的聚丙烯酰胺凝胶上的微球位移来量化细胞产生的力。虽然TFM已广泛应用于乳腺癌、肺癌和前列腺癌模型，但其在胶质母细胞瘤中的应用仍然有限。据研究者所知，尚未有已发表的研究探讨先前的培养条件——特别是2D与3D胶原微环境——如何在GB细胞上留下持久的机械表型印记，即使这些细胞随后被重新接种在相同的2D基底上。这种方法弥合了胶质母细胞瘤中维度培养历史与动态细胞力学之间的鸿沟，揭示了机械记忆的影响。

为了深入探究这一问题，来自德国海德堡大学分子系统工程与先进材料研究所(IMSEAM)的研究团队在《Bioactive Materials》上发表了他们的最新研究成果。他们表征了两种GB细胞系(LN229和T98G)以及非恶性人小胶质细胞系HMC3所施加的牵引应力，并比较了它们之间的差异。为了研究维度性的影响，细胞分别在基于I型胶原的2D硬质基底和3D软质生物活性基质中进行培养。研究旨在评估维度记忆是否在GB和小胶质细胞中持续存在，并利用明确规定的体外牵引力测定法评估这种现象的生理相关性，同时辅以对粘着斑和细胞刚度的定量分析。

本研究主要采用了以下关键技术方法：使用胶原包被的二维表面和基于胶原的三维生物活性基质进行细胞培养；通过细胞增殖实验(WST-8法)评估细胞在不同条件下的生物活性；制备功能化聚丙烯酰胺(PAA)水凝胶并利用纳米压痕技术表征其机械性能；采用牵引力显微镜(TFM)结合KLT算法和FTTC方法定量分析细胞产生的牵引应力和应变能；通过免疫荧光染色和图像处理分析细胞形态、细胞骨架组织和粘着斑动力学；使用基于光纤的纳米压痕仪在生理温度下测量单细胞的杨氏模量。

2. 结果与讨论

研究人员首先通过增殖实验确定了基于I型胶原的基底组成是否影响HMC3、LN229或T98G的生物活性。所有细胞系在三种条件下（对照、2D胶原涂层和3D胶原基质）都保持了增殖能力，表明胶原基基底没有损害它们的生物活性。然而，实验揭示了细胞系间增殖动态的明显差异。HMC3小胶质细胞在对照和2D条件下显示出相似的增殖趋势，而在3D胶原基质中则表现出更慢的增殖和更长的复制时间，表明基质的维度性比基底组成本身更能影响其增殖能力。LN229胶质母细胞瘤细胞在所有三种条件下表现出相当的总体增殖率，但它们在3D基质中的复制时间比在2D或对照条件下更短，表明基质维度性对其复制时间有微妙影响。而T98G胶质母细胞瘤细胞在2D胶原条件下比对照表现出更快的增殖，与3D基质相比，2D和对照条件支持更高的增殖率，并且在2D和3D环境之间观察到复制时间的明显差异。

牵引力显微镜分析

基于机械验证，研究人员进行了TFM实验，以量化细胞力如何使嵌入荧光微球的聚丙烯酰胺基底变形。通过共聚焦显微镜追踪X/Y平面上的微球位移，并基于计算分析将其转换为牵引应力。对先前在2D或3D胶原环境中培养的HMC3、LN229和T98G细胞为变形基底所做的机械功（量化为总应变能）进行了总结。

值得注意的是，胶质母细胞瘤细胞即使被重新接种到2D TFM基底上后，仍保留了独特的生物力学表型。具体而言，与2D培养的对应细胞相比，先前在3D中培养的LN229和T98G细胞施加的牵引应力和总应变能显著更低，这与人类干细胞中描述的机械记忆效应一致。这些差异可归因于预培养调节期间经历的微环境背景以及胶质母细胞瘤和小胶质细胞固有的细胞特性。

胶质母细胞瘤细胞系(LN229和T98G)在比较经历了2D和3D预培养条件后的微环境变化时，显示出总应变能的显著差异。这表明，在2D胶原表面上预培养然后重新接种在扁平聚丙烯酰胺基底上的细胞通常会铺展并形成广泛的粘着斑，它们在坚硬表面上产生强大的局部拉力，产生更高的总应变能和牵引应力。相比之下，3D胶原生物活性基质为细胞创造了更生理相关的环境。根据细胞的内在特性，它们通常采用更圆形或细长的形态，具有更少、更动态的粘附。这种改变的组织，即减少的细胞-基底耦合，通常导致更低的总应变能和总体牵引应力。

细胞形态与粘附分析

接下来，为了研究先前培养维度性对细胞形态和粘附的影响，研究人员对先前在2D或3D胶原环境中培养的HMC3小胶质细胞以及LN229和T98G胶质母细胞瘤细胞进行了F-肌动蛋白、纽蛋白和细胞核的免疫染色，同时也对在常规塑料（培养瓶）条件下维持的细胞进行了染色。在2D胶原基底或塑料上先前培养的细胞表现出宽阔、铺展良好的形态和更大的细胞-基质接触面积，与已建立的2D适应表型一致。相反，从3D胶原基质中回收的细胞显示出明显的形态变化，包括铺展面积的显著减少，这在HMC3小胶质细胞中尤为明显，而LN229和T98G胶质母细胞瘤细胞的细胞面积减少则较为适度。

对纽蛋白的免疫染色揭示了所有三种细胞系中在2D和3D培养的细胞之间不同的粘着斑特征。在2D中，细胞表现出更大、更成熟的粘着斑，通常位于细胞外围并与显著的肌动蛋白应力纤维相关。相比之下，从3D胶原基质中回收的细胞显示出更小、更点状的粘着斑，肌动蛋白纤维形成减少，与更软、异质的微环境适应一致。

单细胞力学表征

为了进一步表征先前维度环境如何影响细胞自身的内在机械特性，研究人员接下来检查了细胞本身的固有机械特性。具体而言，在使用三种不同条件：常规塑料培养瓶（对照）、I型胶原包被的2D表面或I型胶原3D支架培养后，使用单细胞纳米压痕测量了HMC3、LN229和T98G细胞的刚度（杨氏模量）。研究发现HMC3和LN229细胞在2D和3D预培养条件之间的刚度没有显著差异。相比之下，与2D相比，T98G细胞在3D胶原培养后表现出杨氏模量的显著降低。

4. 结论

总之，本研究证明了预培养环境的维度性赋予了胶质母细胞瘤细胞一种机械记忆，即使当它们被重新接种到标准化的2D表面上时，这种记忆仍然持续存在。这支持了我们的假设，即细胞保留了它们先前2D或3D微环境的生物力学印记。具体而言，T98G胶质母细胞瘤细胞表现出显著的记忆效应，在3D预培养后显示出显著更低的牵引力和应变能，同时尽管粘着斑数量和面积在统计上未改变，但细胞刚度存在明显差异。而LN229胶质母细胞瘤细胞响应维度性变化调整其粘附结构和牵引输出，同时保持皮质刚度，反映了一种独特的、细胞类型特异性的适应策略。相比之下，HMC3小胶质细胞显示出最小的机械记忆证据，在预培养条件之间保持稳定的牵引力和刚度，尽管粘着斑数量和大小有适度但显著的变化，并且细胞铺展面积有显著变化。这些发现突出了恶性和非恶性脑驻留细胞之间机械适应的异质性。

这些发现强调，牵引力生成、粘着斑定量和皮质刚度各自报告了细胞力生成机器的不同方面，并且不一定总是以相同的方式相关。这种解耦与先前的报告一致，即成熟的粘着斑可以在没有进一步生长的情况下承受高张力，并且纳米压痕主要探测的是顶端皮质而不是更深的应力纤维。通过量化所有三个参数并一致地报告p值，研究人员捕捉到了有生物学意义的、细胞系特异性的反应。对于粘着斑测定，样本量较为有限，研究人员通过效应大小分析来补充这一点，以加强解释。

最终，我们的工作强调了在胶质母细胞瘤机械生物学的体外模型中考虑机械记忆和细胞类型异质性的重要性。将3D生物活性基质纳入实验流程，并检查预培养条件如何影响后续的2D测定，为了解肿瘤-微环境相互作用提供了额外的见解。虽然星形胶质细胞或神经干细胞经常被用作胶质母细胞瘤的谱系对照，但我们纳入HMC3小胶质细胞 specifically probes了非恶性生态位细胞而非肿瘤生成谱系差异的独特力学。我们预计这种多测定、预培养和重新接种的方法可以为未来关于胶质母细胞瘤进展和与微环境相互作用的研究提供信息。