大豆内生菌外代谢组分析：揭示抗尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的拮抗机制与代谢基础

本综述系统探讨了从大豆根部分离的三株芽孢杆菌（Bacillus spp.）对尖孢镰刀菌（F. oxysporum）的拮抗作用及其分子机制。研究结合16S rRNA测序、扫描电子显微镜（SEM）观察和非靶向代谢组学（LC-MS/MS）技术，揭示Bacillus-HT1和Bacillus-HT2通过产生表面活性素C（surfactin C）、杆菌菌素（bacillibactin）、褐霉酸（fusidic acid）和多种脂肪酸等抗真菌代谢物，显著抑制病原菌生长，而Bacillus-HT3因缺乏相关代谢物而无此活性。该研究为开发基于微生物的绿色生物防治剂提供了理论依据，对减少化学农药使用、促进农业可持续发展具有重要意义。

　　

摘要

大豆（Glycine max [L.] Merr.）作为全球重要的经济作物，其生产常受尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的根腐病威胁。化学杀菌剂的使用虽能控制病害，但易导致环境污染和生态系统破坏。植物内生菌作为一种可持续替代策略，通过产生生物活性代谢物抑制病原菌生长，已成为研究热点。本研究从大豆根部分离出三株芽孢杆菌（Bacillus-HT1、Bacillus-HT2和Bacillus-HT3），通过分子鉴定、拮抗实验和代谢组学分析，系统评估了其抗真菌潜力及作用机制。

引言

大豆根际微生物群落包括根瘤菌、植物生长促进细菌和丛枝菌根真菌等有益微生物，它们通过直接促进植物生长或间接拮抗病原菌（如尖孢镰刀菌）发挥作用。近年来，组学技术（如代谢组学）与生物信息学的结合，为揭示微生物-植物互作机制提供了强大工具。本研究旨在利用非靶向代谢组学（LC-MS/MS）技术，解析大豆内生芽孢杆菌的外代谢组特征，鉴定其抗真菌活性代谢物，为开发新型生物防治剂提供依据。

材料与方法

样品采集与内生菌分离

大豆根样采集自加拿大魁北克省麦克吉尔大学Agronomy Research Center田间试验点。根样经表面灭菌（70%乙醇和3%次氯酸钠处理）后，通过研磨和稀释涂布法分离内生菌，并在King’s B培养基、胰蛋白酶大豆琼脂（tryptic soy agar）和营养肉汤琼脂（nutrient broth agar）上纯化培养。

分子鉴定与系统发育分析

通过16S rRNA基因测序（使用引物27F和1492R）对分离菌株进行鉴定，序列通过BLAST与NCBI数据库比对，并利用MEGA11软件构建系统发育树（邻接法，最大复合似然模型）。

抗真菌活性测定

采用双培养对峙实验，将细菌培养物（10⁸ CFU/mL）与尖孢镰刀菌菌饼共培养于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板，25℃黑暗培养3天后观察抑菌圈。通过扫描电子显微镜（SEM）观察真菌菌丝形态变化（样品经戊二醛固定、乙醇梯度脱水和临界点干燥后镀金钯观察）。

代谢组学分析

细菌在胰蛋白酶大豆肉汤（tryptic soy broth）中培养48小时后，收集细胞培养上清液（CFS），经离心、过滤和冻干后，用50%甲醇-PBS缓冲液（pH 7.2）重溶。LC-MS/MS分析使用Q-Exactive质谱仪（Thermo Fisher），正负离子模式采集数据（m/z范围80–1200，分辨率70,000），数据依赖采集（DDA）模式获取MS/MS谱。原始数据经MetaboAnalyst 6.0处理，进行峰值提取、多变量分析（PCA、PLS-DA）和代谢物注释（基于KEGG、HMDB、MoNA等数据库）。

结果

分子鉴定与系统发育

三株分离菌（HT1、HT2、HT3）经16S rRNA测序鉴定为芽孢杆菌属。Bacillus-HT1和Bacillus-HT2与Bacillus velezensis相似度分别为98.94%和98.96%，而Bacillus-HT3与Bacillus thuringiensis相似度为99.48%。系统发育分析显示，HT1和HT2聚为一支，与HT3明显分开。

抗真菌活性

对峙实验表明，Bacillus-HT1和Bacillus-HT2对尖孢镰刀菌具有显著拮抗作用，抑菌圈明显，而Bacillus-HT3无抑制活性。SEM观察发现，HT1和HT2处理后的真菌菌丝出现皱缩、变形和破裂（图2D、F），对照组和HT3处理组菌丝形态正常。

代谢组学分析

多变量分析（PCA和PLS-DA）显示，HT1和HT2的代谢谱高度相似，但与HT3显著差异（图3、4）。正离子模式中，HT1 vs HT3和HT2 vs HT3分别检测到739/2267和823/2241个显著上/下调峰值；负离子模式中，HT1 vs HT3和HT2 vs HT3分别有611/1761和678/1755个差异峰值（图5）。KEGG富集分析表明，差异代谢物涉及抗生素合成（如单环β-内酰胺和新生霉素）、脂肪酸代谢和铁载体生物合成等通路（图6、7）。

代谢物注释

通过MS/MS碎片匹配和数据库比对，鉴定出多种抗真菌代谢物（表2、3）。Bacillus-HT1和HT2共同产生表面活性素C（surfactin C，m/z 1058.6719）和杆菌菌素（bacillibactin，m/z 883.2625），相似度评分均＞50。此外，HT1特异性产生褐霉酸（fusidic acid，m/z 539.3329）、大尿氨酸（kynurenine，m/z 209.0924）和多种脂肪酸（如棕榈酸、羟基十二酸）；HT2则产生硬脂酸（stearic acid，m/z 283.2644）和香叶酸（geranic acid，m/z 169.1223）。这些代谢物在HT3中均未检测到。

讨论

本研究揭示Bacillus-HT1和Bacillus-HT2通过产生非核糖体肽（如表面活性素和杆菌菌素）和脂肪酸类化合物，有效抑制尖孢镰刀菌生长。表面活性素可通过破坏细胞膜完整性、诱导蛋白表达异常和DNA结合抑制真菌增殖；杆菌菌素作为铁载体，通过螯合铁离子抑制病原菌代谢；脂肪酸（如棕榈酸和硬脂酸）直接破坏菌丝结构。这些发现与既往研究一致，如Liu等报道表面活性素生产者Bacillus subtilis可导致镰刀菌菌丝畸形，Kumar等证实杆菌菌素对多种植物病原真菌具有广谱抑制活性。

代谢组学数据进一步支持了表型观察：HT1和HT2的代谢谱高度相似且富集于抗生素合成通路，而HT3缺乏相关代谢物。此外，HT1产生的7-O-琥珀酰大环内酯（7-O-succinyl macrolactin A）和HT2产生的硬脂酸，均为已知抗真菌剂，增强了菌株的生物防治潜力。

结论

大豆内生芽孢杆菌通过分泌多种抗真菌代谢物，实现对尖孢镰刀菌的有效拮抗。本研究通过整合分子生物学、显微技术和代谢组学，揭示了Bacillus-HT1和Bacillus-HT2的代谢基础，为其作为绿色生物防治剂的开发提供了科学依据。未来研究需结合转录组学、基因组学和蛋白质组学，进一步解析这些菌株的促生长和抗病机制，推动其在可持续农业中的应用。