SETX缺陷细胞中R-loop相关双链断裂通过断裂诱导复制修复的机制研究

为解决SETX缺陷导致的基因组不稳定问题，研究人员开展R-loop相关双链断裂修复机制研究，发现BIR（断裂诱导复制）被激活修复此类损伤，揭示非经典末端切除依赖RAD52和XPF，并证实SETX缺失与PIF1、RAD52、XPF缺失存在合成致死效应，为靶向治疗SETX缺陷肿瘤提供新策略。

　　

在基因组稳定性维护中，DNA双链断裂（DSB）是最危险的损伤类型，若修复不当可导致细胞死亡或癌变。同源定向修复（HDR）和末端连接是主要修复途径，其中断裂诱导复制（BIR）专门处理单端DSB（如复制叉崩溃和端粒侵蚀）。然而，双端DSB（deDSB）的修复机制，尤其在R-loop（RNA-DNA杂交结构）累积的背景下，尚不明确。SETX（senataxin）作为一种RNA-DNA解旋酶，负责解析R-loop，其缺陷与神经退行性疾病和癌症相关，但如何影响DSB修复路径选择仍待探索。

本研究由Tong Wu等人在《Cell Reports》发表，通过构建EGFP报告系统（EGFP-HR和EGFP-BIR）、染色质免疫沉淀（ChIP）、DNA-RNA免疫沉淀（DRIP）、原位邻近连接 assay（PLA）和定量末端切除 assay等关键技术，结合基因敲除（CRISPR）和RNA干扰（shRNA）手段，使用U2OS细胞模型进行机制剖析。

SETX缺失以R-loop依赖方式诱导HR和BIR的超重组

通过EGFP报告系统，作者发现SETX缺失显著提高I-SceI酶切后的EGFP阳性细胞比例，表明HR（短片段基因转换，STGC）和BIR（长片段基因转换，LTGC）均增强。突变SETX解旋酶结构域或过表达RNASEH1（降解RNA-DNA杂交体）可逆转该现象，证实R-loop积累是关键驱动因素。

SETX缺陷细胞的超重组由BIR样机制介导

通常HR/STGC不依赖PIF1 helicase，但SETX缺失后，HR转变为依赖PIF1和POLD3的BIR样修复。ChIP分析显示SETX缺陷细胞中PIF1向DSB位点招募增强，且SETX与PIF1缺失呈现合成致死，RNASEH1过表达可挽救该表型，表明BIR机制活化是细胞生存所必需。

SETX缺失通过非经典路径诱导过度末端切除

SETX缺陷细胞显示IR照射后RPA2磷酸化（pRPA2）增强，且末端切除在DSB近端（145 bp）比远端（>2 kb）更显著。该过程依赖MRE11（但非其内切酶活性）和XPF，而非CtIP，且需RAD52和XPF的招募。DRIP和ChIP证实RAD52识别R-loop并招募XPF，启动非经典切除，而BLM、DNA2和EXO1负责长效切除。

R-loop积累通过PCNA泛素化和PIF1加载触发BIR起始

PLA实验表明SETX缺陷细胞中PCNA及其泛素化（PCNA-Ub）和PIF1在DSB位点聚集增加，且依赖转录和Polα-primase介导的末端填充合成。机制上，R-loop与填充合成冲突导致复制停滞，诱发PCNA-Ub和PIF1招募，从而激活BIR。即使抑制超切除（如XPF缺失），PCNA-Ub仍部分存在，表明R-loop积累本身足以启动BIR。

研究结论与意义

本研究揭示SETX缺陷通过R-loop积累激活非经典RAD52/XPF依赖的末端切除和BIR修复机制，解决了R-loop相关deDSB的修复难题。该发现拓展了BIR在生理和病理条件下的功能范围，为SETX缺失相关肿瘤（如高突变癌症）提供了靶向治疗策略：抑制PIF1、RAD52或XPF可选择性杀伤SETX缺陷细胞。研究还提出R-loop稳态是决定HR与BIR路径选择的关键因素，为理解转录-复制冲突下的基因组稳定性维护提供了新视角。