mTORC1与GSK3双相调控B细胞转录组：揭示淋巴瘤与自身免疫疾病新靶点

本刊推荐：为解析B细胞转录协调机制，研究人员通过47个CRISPR筛选构建包含4440个调控因子和17638个连接关系的调控网络，发现mTORC1和GSK3以相反方式调控细胞周期和免疫应答基因。该研究揭示了免疫应答基因通过模块化通路驱动电路进行调控，为淋巴瘤和自身免疫疾病提供了新的治疗靶点。相关成果发表于《Cell Reports》。

　　

在免疫调控领域，一个核心问题在于细胞如何协调转录程序以响应代谢和信号线索。尽管单个转录因子（TF）和信号通路已被充分表征，但基因表达究竟是由离散的基因特异性机制控制，还是通过整合的高阶调控程序运作，仍然存在巨大知识空白。这种调控架构的解析对于理解免疫细胞如何解读和响应环境刺激至关重要，特别是在B细胞活化过程中——当B细胞进入生发中心（GC）反应，经历亲和力成熟并分化为抗体分泌浆细胞或记忆B细胞时，任何调控异常都可能导致免疫缺陷、自身免疫或B细胞恶性肿瘤。

以往研究多局限于动物模型和细胞系，虽然发现了B细胞功能的关键效应因子，但全球范围内解析B细胞基因转录调控的策略仍然有限。尽管CRISPR功能基因组学筛选与流式细胞分选（FACS）结合已用于研究免疫和非免疫细胞中单个基因的调控，但系统性绘制人类B细胞转录调控图谱仍面临挑战。

在这项发表于《Cell Reports》的研究中，Kalchschmidt等人开发了高通量CRISPR-Cas9筛选平台，通过47个转录报告基因系统绘制了B细胞转录调控网络。他们意外发现核糖体生物发生和翻译等核心细胞过程可作为环境依赖的激活因子或抑制因子，占单个筛选中超过30%的基因调控因子。更引人注目的是，研究揭示了B细胞转录组中存在复杂的双相调控架构：mTORC1和GSK3通过相反活性塑造转录组格局。用雷帕霉素抑制mTORC1虽然抑制了细胞周期和代谢基因，却反常地增强了B细胞关键基因的表达——这一效应被GSK3拮抗。这表明B细胞转录受整合的、通路驱动的电路控制，为调控淋巴瘤和自身免疫疾病的基因表达提供了新靶点。

研究人员采用的主要技术方法包括：在弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中构建47个转录报告细胞系；进行全基因组CRISPR-Cas9缺失筛选；通过流式细胞术定量基因表达变化；建立交互式数据门户B-LEARN；使用RNA测序（RNA-seq）分析转录组；染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）验证转录因子结合；蛋白质组学分析；以及体外激酶抑制试验验证化合物特异性。

研究结果首先通过OCAB报告基因验证了筛选平台的可靠性。研究发现FLI1是OCAB的最高排名激活因子，其缺失会降低报告基因荧光，ChIP-seq显示FLI1直接结合OCAB启动子和上游BRD4⁺超级增强子元件。相反，SPEN作为最高排名抑制因子，其缺失增加mO-OCAB表达。值得注意的是，研究人员排除了11号染色体上由于Cas9诱导基因组不稳定性导致的假阳性 hits。

通过47个报告细胞系的筛选，研究构建了包含4440个调控因子（1685个激活因子、1753个抑制因子和1002个环境依赖型调控因子）和17638个调控连接的全面网络。KCTD5（一种泛素E3连接酶底物适配蛋白）成为最一致的顶级激活因子，而SPEN是最常见的抑制因子。研究发现泛素通路在B淋巴细胞基因表达调控中具有出人意料的广泛作用。

为增强数据可及性，研究团队开发了B-LEARN交互式在线数据门户，提供四大核心功能：调控因子搜索、靶基因搜索、共调控分析和调控网络可视化。通过该平台，用户可以直观探索先前未被认识的基因调控相互作用和机制。

通过识别所有筛选基因对之间的共享调控因子并应用层次聚类，研究发现了B细胞中两个不同的基因群：Group 1（17个基因）具有高度共享的激活因子，Group 2（18个基因）显示高度共享的抑制因子。STRING分析结合马尔可夫聚类显示，核糖体生物发生和翻译既可作为激活因子也可作为抑制因子功能，其中62%的核糖体调控因子（175/282）同时作为激活因子和抑制因子发挥作用。值得注意的是，Group 1基因优先被核糖体/翻译调控因子激活，而Group 2基因主要被相同因子抑制。

研究发现mTORC1信号是这一转录反应背后的主要调控因子。雷帕霉素处理导致Group 1基因表达减少，同时增加Group 2基因表达，与CRISPR筛选结果高度一致。虽然下调在24小时内明显，但Group 2基因的上调仅在48小时后出现，表明存在延迟的补偿反应。

通过RNA-seq分析，研究发现mTORC1抑制在SU-DHL-4细胞中产生2458个差异表达基因（DEG），其中下调的基因簇为细胞周期调控和代谢，而上调的基因主要是Group 2基因，属于最大的上调簇——免疫反应激活相关。这一发现看似矛盾，因为雷帕霉素作为免疫抑制剂使用。基因集富集分析（GSEA）证实了染色体分离和代谢通路的下调，以及细胞质翻译和适应性免疫反应基因的增加。

在原发性人B细胞中，雷帕霉素处理也显示出类似的转录反应：染色体分离和代谢过程下调，而细胞因子介导的信号通路上调。主成分分析（PCA）显示，虽然SU-DHL-4和原代B细胞沿PC1明显分离，但它们对雷帕霉素的反应非常相似，这在PC2中得到反映。差异表达分析显示，两种细胞类型中对雷帕霉素响应且调控方向相同的DEGs存在强烈重叠。

为探究mTORC1抑制意外诱导免疫反应基因的机制，研究人员在雷帕霉素存在下进行了三个报告细胞系（BTG2、CD79B和OCAB）的CRISPR-Cas9筛选。筛选鉴定出18个在所有三个雷帕霉素CRISPR筛选中常见的因子，其中FKBP1A（编码FKBP12，雷帕霉素诱导的mTORC1抑制的关键介质）是顶级调控因子，作为内部对照。此外，六个额外调控因子（NAE1、UBA3、NEDD8、TCEB2、CTDSPL2和TCERG1）在正常生长条件下未检测到，但在所有三个雷帕霉素筛选中以高置信度识别，表明它们在mTORC1抑制反应中具有共享作用。

研究发现GSK3是抵消mTOR对免疫反应基因调控的关键因子。用两种不同GSK3抑制剂（LY2090314和CHIR99021）处理可拮抗雷帕霉素诱导的Group 1和Group 2基因表达变化。这种效应需要同时抑制GSK3A和GSK3B，因为只有sgRNA介导的共缺失——而非单独靶向——足以抵消雷帕霉素反应。

GSK3抑制的全局转录组效应显示，83%的DEGs被下调。直接比较GSK3抑制剂和雷帕霉素处理的SU-DHL-4细胞的DEGs发现，70%被GSK3抑制下调的基因在mTOR抑制时被上调，表明这些通路间存在互惠调控关系。这些互惠调控基因在免疫反应通路中显示强烈功能富集，突出了GSK3在mTORC1信号下游调节免疫基因表达中的关键作用。

对GSK3抑制剂、雷帕霉素或其组合处理的细胞的全局转录组谱比较表明，雷帕霉素诱导的细胞周期基因（簇1）下调和免疫反应基因（簇2）上调是GSK3依赖性的，因为它们的表达水平在GSK3抑制剂共处理后恢复到对照水平。然而，雷帕霉素介导的翻译因子表达增加（簇3）是GSK3非依赖性的，这些基因相较于对照保持升高，这可能解释了GSK3抑制剂和雷帕霉素共处理时独特的PC2谱。

研究结论表明，B细胞转录组受整合的、通路驱动的电路控制，mTORC1和GSK3通过相反方式调控细胞周期和免疫应答基因。这种转录平衡的发现为治疗癌症、自身免疫 disorders 和移植中使用mTOR抑制剂以及新兴的GSK3靶向疗法（如阿尔茨海默病、糖尿病和双相障碍）提供了新的策略思路。理解mTORC1-GSK3转录轴可能指导在健康和疾病中微调免疫反应的治疗策略。

该研究的局限性包括筛选基因和细胞系数量受限；基于GC衍生淋巴瘤细胞系的结果可能无法代表各种B细胞癌症或原代B细胞中的全部转录调控；严格RRA分数阈值会减少候选调控因子数量；以及当前方法无法区分直接和间接基因调控。未来研究需要包括更多基因、多样化细胞系模型和原代细胞，并采用ChIP-seq和RNA-seq等补充方法在调控因子缺失细胞中解析这些复杂机制。