无基质胶培养的前列腺癌患者来源类器官保留肿瘤谱系并揭示普遍改变的信号通路

本研究针对前列腺癌(PCa)研究中患者来源类器官(PDOs)培养成功率低和良性细胞过度增殖的难题，开发了无基质胶(Matrigel-free)培养系统。通过表型和单细胞转录组(scRNA-seq)分析，证明该系统提高了AR阳性PCa PDOs的成功率，保留了患者特异性细胞群和雄激素受体(AR)信号活性，并富集中间细胞类型。研究构建了前列腺PDO单细胞图谱(PPScA)，揭示了体外培养中普遍改变的信号通路，为前列腺癌研究提供了方法学改进和生物学新见解。

　　

前列腺癌研究领域长期面临有效模型稀缺的挑战。与乳腺癌等癌症相比，前列腺癌细胞系数量严重不足，在癌症细胞系百科全书(CCLE)中仅占0.52%。更严峻的是，最常用的前列腺癌细胞系多来源于转移灶，少数表达雄激素受体(AR)且对雄激素剥夺治疗敏感。由于前列腺癌高度依赖AR信号，研究模型的可靠性至关重要。患者来源异种移植(PDX)模型同样稀缺，仅占所有公开PDX模型的0.17%，且缺乏某些分子和临床亚型。

近年来，患者来源类器官(PDOs)技术为前列腺癌研究带来了新希望。这种三维培养模型能够更好地模拟原始组织的结构和异质性，展示出增强的功能性和分子相似性。然而，前列腺癌PDOs的应用一直受到培养成功率低、良性上皮过度生长和体外肿瘤细胞扩增有限等问题的制约。

传统方法将肿瘤细胞嵌入基质胶(Matrigel)——一种主要包含层粘连蛋白I和胶原IV的小鼠来源细胞外基质(ECM)，并浸泡在特定器官培养基中培养。虽然这种技术在多种肿瘤类型中表现出潜力，但在前列腺癌背景下却效果不佳。尽管有研究成功从晚期转移性前列腺癌标本中建立了可扩展的类器官模型，但这些模型仅代表了能够成功生长的一小部分前列腺癌，可能无法重现包括原发疾病在内的广泛前列腺癌谱系。

Robin Dolgos等人在《Cell Reports》上发表的研究，正是为了解决这些挑战。研究人员利用163个前列腺癌临床样本，通过表型和单细胞RNA测序(scRNA-seq)比较分析，证明在无基质胶培养系统中培养的前列腺癌患者来源类器官表现出细胞异质性，保留了患者特异性细胞群体，并揭示了体外培养中普遍改变的信号通路。

研究团队使用了多种关键技术方法：对136个PCa临床样本进行表型筛选和培养条件优化；对27个PCa临床样本和4个良性PDO系进行基质条件测试；通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析9个PDO培养物的细胞异质性；利用免疫组化(IHC)、免疫荧光(IF)和荧光原位杂交(FISH)验证类器官的分子特征；构建整合性前列腺PDO单细胞图谱(PPScA)；使用InferCNV分析拷贝数变异。

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Matrigel-based culture conditions are inefficient and yield basal-like benign organoids

研究人员首先评估了传统基质胶培养系统的效率。在136个前列腺癌样本中，虽然一半(50.0%)在传代0时出现了短期类器官生长，但仅有少数(8.8%)被证实具有前列腺癌样特征。这些短期培养物中具有高肿瘤细胞含量的主要来自转移灶或局部复发(经尿道膀胱肿瘤切除术：TURB)标本。相反，根治性前列腺切除术(RP)来源的类器官培养中只有少数(7.5%)含有罕见肿瘤细胞伴随大量良性细胞，突显了异质性原发样本中良性过度生长的挑战。

Matrigel-free conditions favor the growth of organoids enriched in luminal and PCa features

为了克服这些限制，研究团队测试了不同的细胞外基质。令人惊讶的是，无基质胶培养不支持4个良性PDO系中的3个生长，但支持了5/6前列腺癌患者来源样本的纯粹管腔样类器官生长，显示了这些培养条件对管腔细胞的选择和/或促进作用。在21个样本的扩大实验中，无基质胶条件在传代0时的生长率达到90.5%，而基质胶条件为76.5%。

scRNA-seq analysis uncovers cellular heterogeneity and AR-active luminal/tumor cells in Matrigel-free-derived organoids

通过单细胞RNA测序分析，研究人员发现了8个不同的细胞簇。簇1、8、3和4在无基质胶来源的细胞中富集，而簇5、6和7在基质胶来源的细胞中富集。差异表达分析将这些簇分类为"基底/hillock"、"club"、"transitioning"和"管腔/肿瘤"细胞。特别是簇1和8被定义为"管腔/肿瘤"，因为它们共表达管腔标志物(KLK3和NKX3-1)和前列腺癌标志物如AMACR、FOLH1(编码PSMA)和KLK4。

Identification of markers distinguishing between luminal/tumor and benign cell subtypes ex vivo

研究人员发现了能够清楚区分管腔/肿瘤细胞和其他良性细胞的生物标志物。GSTP1表达缺失在管腔/肿瘤簇的大多数细胞中观察到，而在非肿瘤簇的几乎所有细胞中高表达。S100A6在基底/hillock、club和transitioning亚群中高表达且均匀，而在管腔/肿瘤组中表达较低。

Expression of laminin-binding integrins is a hallmark of organoids successfully derived in Matrigel

研究表明，胶原结合ITGA2和层粘连蛋白结合整合素ITGA3、ITGA6和ITGB4几乎仅由非肿瘤细胞类型表达，特别是在基底/hillock细胞中富集，这可能解释了它们对基质胶的亲和力。相比之下，管腔/肿瘤细胞无论培养条件如何，这些整合素的表达都很弱，但富含精氨酰甘氨酰天冬氨酸(RGD)结合整合素ITGAV和ITGB5。

Matrigel-free organoids preserve patient-specific transcriptomic features and diverse PCa lineages

重要的是，无基质胶类器官保留了患者特异性转录组特征。研究人员确定了4个标志物(ERG、ALDH1A1、VIMENTIN和MSH2)能够区分患者特异性PDOs，这些标志物在亲代患者肿瘤中的表达通过免疫组化得到了验证。

The PPScA captures diverse cellular identities and a spectrum of malignancies

研究团队整合了新生成的数据集和所有已识别的公开可用前列腺PDOs的单细胞RNA-seq数据，生成了整合性前列腺PDO单细胞图谱(PPScA)。该图谱包含来自不同组织来源、类型和分级样本的细胞，以及不同治疗历史的患者。

The PPScA reveals universally altered pathways in PCa PDOs

PPScA揭示了PDO肿瘤细胞与原发性前列腺癌样本肿瘤细胞相比普遍改变的信号通路。这些通路包括miRNA转录的普遍减少、翻译起始的调控和未折叠蛋白反应，突出了广泛的合成代谢减弱。最重要的是，研究发现与患者原发组织相比，PDO肿瘤细胞中的AR激活评分全局降低，这反映在直接AR转录靶点如KLK3和KLK2的表达降低。

Matrigel-based culture induces keratinocyte-like lineage programs

研究发现基质胶来源的类器官表现出角蛋白细胞样转录组特征，这些特征在正常前列腺数据集中不存在或在无基质胶类器官中表达水平低得多。这表明基质胶衍生的前列腺癌类器官表现出不代表正常前列腺上皮的转录组特征，提示可能存在体外诱导的转录组特征。

这项研究的结论强调了无基质胶培养系统在提高前列腺癌类器官成功率、保持谱系特异性和限制良性过度生长方面的重要价值。研究发现无基质胶条件能够富集具有AR信号活性的管腔/肿瘤细胞，而基质胶条件主要产生良性基底细胞。通过单细胞分析，研究人员重新定义了细胞类型特征，识别了区分肿瘤与其他细胞类型的生物标志物，并证明层粘连蛋白结合整合素的表达是基质胶来源类器官的标志。

该研究构建的前列腺PDO单细胞图谱(PPScA)为前列腺癌研究领域提供了宝贵的资源，能够深入探索体外相关的细胞状态和类器官保真度，比较不同的方法学或感兴趣的模型。这些发现为短期培养提供了方法学改进，为细胞生物学提供了新见解，并提供了先前未探索的体外细胞谱系生物标志物，共同代表了该领域的重要进展。

研究的局限性在于无基质胶类器官培养系统与传统类器官定义的某些方面相悖，且肿瘤细胞的有限扩增仍然是一个挑战，类器官只能维持几个传代。尽管如此，这项研究为前列腺癌研究提供了重要的方法学改进和生物学见解，为未来研究提供了新的方向和资源。