利用嗜热真菌Thermothelomyces heterothallica C1平台高效表达SARS-CoV-2全长刺突蛋白及其功能特性研究

本刊推荐：为应对COVID-19疫苗供应链不稳定及可及性差异问题，研究人员利用工程化丝状真菌平台Thermothelomyces heterothallica C1开展SARS-CoV-2全长刺突蛋白（Spike）的高效表达研究。结果表明，C1平台生产的Spike蛋白具有高热稳定性（37°C下7天活性无显著损失）、可冻干保存，且经糖基化修饰后可获得类人源唾液酸化N-糖谱。小鼠免疫实验显示其诱导的体液免疫应答与哺乳动物平台相当。该研究为快速、低成本生产复杂糖基化重组蛋白疫苗提供了新策略。

　　

2019年底爆发的COVID-19疫情已造成全球超过7.7亿人感染，死亡病例突破700万。疫苗虽在短期内预防了约1440万死亡，但全球疫苗接种率存在显著不平等现象。中低收入国家需增加50%以上的医疗支出才能实现70%接种覆盖率，而高收入国家仅需增加0.8%。这一差距凸显出对快速、低成本、易分发的疫苗平台的迫切需求。

在众多疫苗类型中，重组蛋白亚单位疫苗因其生产简便、稳定性好、无需冷链运输等优势，成为提高疫苗可及性的重要选择。SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike）是病毒表面的关键糖蛋白，负责通过ACE2受体介导宿主细胞感染。虽然目前多数疫苗采用受体结合域（RBD）作为抗原，但研究表明包含全长Spike蛋白的疫苗可能诱导更广泛的中和抗体应答。

然而，全长Spike蛋白的生产面临巨大挑战。其分子量大（约135 kDa）、含有22个N-糖基化位点，结构复杂，在传统表达系统中产量低且稳定性差。哺乳动物细胞表达系统成本高昂，细菌系统缺乏糖基化能力，昆虫细胞系统则可能产生免疫原性过强的糖型。

为解决这些问题，加州大学戴维斯分校的研究团队开发了一种创新解决方案——利用工程化的嗜热丝状真菌Thermothelomyces heterothallica C1表达系统。该团队通过基因工程改造，获得了能高效分泌全长Spike蛋白的菌株，并对表达产物进行了全面的理化性质和功能特性研究。相关研究成果发表在《Vaccine》期刊上。

研究人员采用的主要技术方法包括：利用基因合成和分子克隆技术构建Spike蛋白表达载体；通过发酵工程在5 L生物反应器中优化蛋白生产条件；使用切向流过滤（TFF）和亲和层析进行蛋白纯化；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）、生物层干涉技术（BLI）和圆二色谱（CD）分析蛋白结合活性和二级结构；通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行糖基化位点分析；利用定向分子动力学（SMD）模拟研究蛋白-受体相互作用；最后通过小鼠免疫实验评估蛋白的免疫原性。

3.1. C1-Spike生产

研究人员通过基因工程手段，将编码SARS-CoV-2武汉株（GenBank QHD43416.1）Spike蛋白16-1209位氨基酸的序列克隆到C1表达载体中。该构建体包含furin酶切位点突变（RRAR→GSAS）、双脯氨酸稳定化突变（KV→PP）、foldon三聚化结构域和C-tag标签。发酵115小时后，蛋白产量达到320 mg/L，经SDS-PAGE和Western blot验证在约160 kDa处有清晰条带，比理论分子量（135 kDa）大的原因可能是糖基化修饰。

3.2. 纯化

采用切向流过滤浓缩和一步亲和层析纯化策略，最终获得纯度约88%的Spike蛋白。LC-MS分析确认蛋白序列正确无误，无任何突变。

3.3. 结合动力学

BLI分析显示C1-Spike与ACE2受体的平衡解离常数（K_D）为48.8 nM，与文献报道值（6-133 nM）一致。与中和抗体87G7的结合极其紧密，K_D值低于1.0 pM。经糖基化修饰后，C1-Spike与ACE2的亲和力提高了近一个数量级（K_D=2.54 nM）。

3.4. 二级结构

圆二色谱分析揭示C1-Spike具有高比例的α-螺旋结构（约40%），明显高于CHO或Sf9系统表达的Spike蛋白（约20-25%）。这种结构特征可能与蛋白的高稳定性相关。

3.5. 温度和冻干稳定性

C1-Spike在37°C下保存7天后仍保持结合活性，ELISA信号无显著差异（p=0.106）。冻干处理也不影响蛋白功能（p=0.096），证明其具有良好的稳定性。

3.6. LC-MS/MS分析N-糖基化谱

糖蛋白组学分析显示，未修饰的C1-Spike主要含有高甘露糖和未装饰的N-糖链。经过体外多酶系统修饰后，成功获得了以单唾液酸化复合型N-糖为主的糖型，更类似人源糖基化模式。

3.7. 定向分子动力学

SMD模拟表明，糖基化修饰增强了Spike与ACE2的初始结合力，峰值作用力更高，这与BLI实验中观察到的亲和力提高现象一致。

3.8. 免疫原性评估

小鼠免疫实验显示，C1-Spike诱导的血清 Spike特异性IgG抗体水平和病毒中和能力（ID₅₀）与HEK293表达的Spike蛋白相当，无显著差异。

该研究首次成功在丝状真菌系统中实现SARS-CoV-2全长Spike蛋白的高效表达，产量超过300 mg/L。C1平台生产的Spike蛋白具有正确的空间结构和生物活性，其与ACE2和中和抗体的结合特性与哺乳动物系统表达的蛋白相当。特别值得注意的是，C1-Spike展现出了优异的热稳定性和冻干稳定性，这大大降低了运输和储存要求。

通过体外酶法修饰，研究人员成功将真菌特有的高甘露糖N-糖基化模式转变为更接近人类的唾液酸化复合型糖型，且这种修饰不影响蛋白的抗原性。分子动力学模拟为糖基化影响蛋白-受体相互作用的机制提供了理论解释。

小鼠实验证实C1-Spike具有良好的免疫原性，能够诱导强烈的体液免疫应答，其中和抗体水平与哺乳动物系统表达的蛋白相当。这些结果表明C1平台生产的Spike蛋白完全有潜力作为疫苗抗原使用。

该研究的重要意义在于开发了一种全新的重组蛋白生产平台。与传统哺乳动物细胞表达系统相比，C1系统具有明显优势：菌株倍增时间短（2.5小时 vs 24小时）、培养基成本低、不需要昂贵的血清或生长因子、下游处理无需病毒清除步骤。这些特点使得C1平台特别适合中低收入国家建立自主的疫苗生产能力。

此外，该平台不仅适用于SARS-CoV-2疫苗生产，还可扩展到其他呼吸道病毒疫苗的开发，如流感和呼吸道合胞病毒。更重要的是，成功对高度糖基化的Spike蛋白进行糖型改造的技术，为利用C1平台生产其他需要特定糖基化模式的生物制剂（如治疗性抗体）奠定了基础。

这项研究为全球疫苗可及性问题提供了创新性解决方案，特别有利于资源有限地区建立自主、可持续的疫苗生产能力，对未来应对新发传染病疫情具有重要意义。