三维培养揭示MPS IVA软骨细胞中线粒体-溶酶体互作失调及线粒体稳态失衡的核心机制

本研究针对黏多糖贮积症IVA型（MPS IVA）患者软骨细胞功能障碍的机制展开探索，利用三维培养模型首次系统评估了GALNS酶缺乏导致的溶酶体贮积对线粒体稳态、线粒体自噬、动力学及代谢重编程的深刻影响，揭示了PINK1/Parkin通路抑制、氧化应激增强和糖代谢转换等关键表型，为理解MPS IVA骨骼发育异常的细胞机制提供了新视角。

　　

黏多糖贮积症IVA型（Mucopolysaccharidosis IVA，MPS IVA）是一种常染色体隐性遗传的溶酶体贮积病（LSD），由于N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶（GALNS）基因突变导致酶活性缺失，使得硫酸角质素（KS）和硫酸软骨素6硫酸（C6S）在溶酶体内异常累积。患者主要表现为严重的骨骼发育不良、关节松弛和多系统受累，目前仍缺乏根本治疗方法。以往研究多集中于皮肤成纤维细胞模型，而对疾病核心受累细胞——软骨细胞——在MPS IVA中的病理机制了解甚少。尤其值得注意的是，溶酶体作为细胞内重要的降解中心和信号枢纽，与线粒体之间存在密切的互作关系，涉及代谢交换、自噬调控和细胞死亡等过程。然而，MPS IVA中溶酶体功能缺陷是否以及如何影响线粒体功能，尚缺乏深入的研究。

在这一背景下，Andrés Felipe Leal等人于《Scientific Reports》上发表了一项研究，利用三维（3D）藻酸盐培养体系，首次在人类MPS IVA软骨细胞中系统揭示了线粒体功能紊乱的多个层面，包括线粒体膜电位下降、氧化应激增强、线粒体自噬（mitophagy）受阻、动力学失衡和代谢重编程，从细胞器互作的角度为MPS IVA的骨骼病理提供了新的解释。

本研究主要依托以下关键技术展开：采用藻酸钠（Na-Alg）三维培养系统培养人原代软骨细胞，培养时间达28天；通过液相色谱－串联质谱（LC-MS/MS）定量分析KS积累；利用流式细胞术系统评估细胞凋亡、线粒体膜电位（ΔΨm）、活性氧（ROS）水平、溶酶体和线粒体质量；通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）分析线粒体自噬关键蛋白（PINK1, Parkin, LC3, p62）、线粒体动力学相关蛋白（Drp1, Fis1, Opa1）及线粒体质量标志物（VDAC1, COX4, ANT）；使用实时荧光定量PCR（qPCR）检测线粒体生物发生基因（TFAM, PGC-1α）；借助透射电子显微镜（TEM）观察线粒体形态；并采用Seahorse XFp线粒体压力测试系统全面评估细胞耗氧率（OCR）和糖酵解水平。

结果部分分析如下：

Chondrocyte characterization

研究通过藻酸盐三维培养体系成功培养了野生型（WT）与MPS IVA患者来源的软骨细胞，培养28天后细胞活性仍超过90%。免疫荧光染色显示培养细胞高表达II型胶原（Col II）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）及SOX9，流式细胞术确认CD49c与CD151阳性表达，证明该模型较好地维持了软骨细胞表型。同时，LC-MS/MS检测显示MPS IVA细胞中单硫酸化KS水平显著升高，且GALNS酶活性完全缺失，说明该模型成功模拟了MPS IVA的关键病理特征。

Mitochondrial membrane depolarization triggers apoptosis in MPS IVA chondrocytes

线粒体途径的凋亡在MPS IVA软骨细胞中显著增强。经Staurosporine（STS）诱导后，MPS IVA细胞凋亡率显著高于WT细胞，Caspase 3/7活化水平也明显上升。JC-1探针检测发现，MPS IVA细胞中线粒体膜电位（ΔΨm）显著下降，表明线粒体去极化是凋亡增强的重要诱因。

MPS IVA chondrocytes are highly susceptible to undergoing a pro-oxidant profile

通过H2DCFDA和MitoSOX染色，研究显示MPS IVA软骨细胞中总体ROS和线粒体来源ROS（mt-ROS）水平均显著升高。经Menadione诱导后，MPS IVA细胞的mt-ROS反应更为强烈，表明其氧化应激敏感性增加。

GALNS deficiency-mediated lysosomal dysfunction leads to mitophagy pathway blocking in MPS IVA chondrocytes

溶酶体（LysoTracker）和线粒体（NAO）质量检测均显示MPS IVA细胞中这两种细胞器的质量显著增加。Western Blot结果进一步提示VDAC1、COX4、ANT等线粒体膜蛋白表达上升。在线粒体自噬方面，MPS IVA细胞中PINK1/Parkin通路关键蛋白表达降低，而LC3-II和p62积累，说明自噬流受阻。经CCCP诱导后，PINK1/Parkin表达仍处于低位，而LC3-II/LC3-I比值进一步升高，表明线粒体自噬过程严重受损。

GALNS deficiency-dependent mitophagy flux impairment promotes mitochondrial dynamic dysregulation

线粒体分裂蛋白Drp1与Fis1在MPS IVA细胞中表达上升，融合蛋白Opa1则略有下降，提示线粒体碎片化增加。TEM形态学分析证实MPS IVA细胞中短棒状线粒体比例升高。作为代偿机制，线粒体生物发生相关基因TFAM与PGC-1α的转录水平显著上调。

Disrupted lysosome: mitochondrial crosstalk shifts the metabolic profile of MPS IVA chondrocytes

通过Seahorse能量代谢分析，MPS IVA软骨细胞的基础呼吸、最大呼吸能力、ATP产量和备用呼吸能力均显著下降，质子漏增加，表明氧化磷酸化（OXPHOS）严重受损。细胞代谢向糖酵解倾斜，ECAR/OCR比值升高，胞外乳酸水平上升，提示MPS IVA软骨细胞发生了显著的代谢重编程。

讨论与结论：

本研究系统揭示了MPS IVA软骨细胞中溶酶体-线粒体轴心的重要紊乱。一方面，溶酶体中KS和C6S的积累直接或间接干扰线粒体自噬过程，尤其影响PINK1/Parkin依赖的通路，导致受损线粒体无法有效清除；另一方面，线粒体质量增加、膜电位丧失、ROS过量产生以及碎片化形态增多，表明线粒体稳态严重失衡。这些变化不仅促使凋亡敏感性增加，还引发代谢模式从氧化磷酸化向糖酵解转变，类似于骨关节炎（OA）等退行性关节疾病中的代谢特征。这种代谢转换可能导致微环境酸化和基质金属蛋白酶（如MMP-9）激活，进而加速细胞外基质降解，参与MPS IVA骨骼病变的形成。

该研究首次在人类原代软骨细胞三维模型中揭示MPS IVA的线粒体病理表型，突破了以往成纤维细胞模型的局限，为疾病机制研究和治疗策略开发提供了更接近生理状态的理论依据。未来研究可进一步针对不同GALNS基因突变对线粒体功能的影响展开个性化分析，并探索如酶替代疗法（ERT）或基因治疗（GT）是否可逆转上述线粒体缺陷。此外，调节线粒体自噬、抗氧化处理或代谢干预可能成为MPS IVA治疗的新方向。

综上所述，这项研究不仅深化了对MPS IVA病理机制的理解，也为多种溶酶体贮积症及线粒体相关退行性疾病的研究提供了重要的模型借鉴和理论支持。