基于ncRNA纳米结构多维保守性追踪生物进化起源：phi29噬菌体pRNA的结构与功能演化研究

为解决病毒ncRNA一级序列高度变异导致同源识别困难的问题，研究人员开展基于二级结构保守性的pRNA挖掘研究，通过Infernal和AlphaFold等技术发现12种新型pRNA，证实其二维/三维结构高度保守且与DNA包装马达功能耦合，为RNA世界假说和病毒进化追踪提供关键证据。

　　

病毒和微生物在不断变异和地域性涌现的过程中，如何追溯其进化起源一直是生命科学领域的核心难题。传统基于一级序列同源性的分析方法面临巨大挑战——非编码RNA（ncRNA）的一级序列在不同病毒间高度变异，但它们的二级（2D）和三级结构（3D）却可能保持高度保守。这种结构保守性是否蕴藏着生命演化的关键密码？来自俄亥俄州立大学的研究团队以细菌病毒phi29的包装RNA（pRNA）为突破口，开展了跨越多维结构的演化分析研究。

phi29噬菌体是研究RNA功能的理想模型，它能感染孢子形成的枯草芽孢杆菌，这些孢子如同"活化石"般在土壤中沉睡数百万年而未发生进化。该病毒DNA包装马达中的pRNA分子，不仅能驱动病毒马达进行DNA转运，还具有结合ATP的功能特性。研究人员推测，类似phi29 pRNA的结构可能广泛存在于自然界中，但因其一级序列的多样性，难以通过传统BlastN序列比对进行有效识别。

为了验证这一假说，研究团队采用了一种创新的双路径策略：自上而下的二维结构搜索和自下而上的三维结构组装。他们使用Infernal程序（基于RNA二级结构同源性的搜索工具）对病毒全基因组数据库进行扫描，以phi29、GA1和DLc1的pRNA结构为模板，设置了E值<10^-6和序列覆盖率>0.8的筛选标准。同时运用AlphaFold3进行三维结构预测，Mfold进行二级结构折叠分析，并结合体外功能实验验证pRNA的DNA包装活性。

研究首先发现，与BlastN仅能识别有限同源序列相比，Infernal成功找到了50个pRNA候选物，其中12个为全新发现的pRNA。这些pRNA虽然一级序列差异巨大，但都保持着相似的三向连接结构（3WJ）和左右手环（LH/RH）配对特征。特别值得注意的是，所有pRNA都含有可配对的手环结构，通过三到四个核苷酸的互补配对实现环间相互作用。

功能实验证实了这种结构保守性的生物学意义。当研究人员对phi29 pRNA的左右手环进行配对突变时，发现只有保持互补配对的突变体才能维持病毒DNA包装活性。例如，将左手环突变为A/i而右手环保持野生型（I/i）时，系统完全失活；但当同时引入互补突变（A/i与I/a混合）时，活性得以恢复。这种现象表明pRNA通过手环配对形成六聚体环结构，这是DNA包装马达发挥功能所必需的。

进一步的分析揭示了更深层的保守性机制。在12种新发现的pRNA对应的病毒基因组中，都同时存在另外两个关键马达组件：通道蛋白gp10和ATP酶gp16。通过蛋白质同源性分析发现，gp16的序列保守性高于gp10，这表明ATP酶在进化过程中承受着更强的功能约束。这种"三位一体"的共存现象强有力地支持了这些pRNA确实属于DNA包装马达的组成部分。

三维结构预测结果更加令人惊叹。AlphaFold3预测的phi29 pRNA的3WJ核心结构与实验测得的晶体结构（PDB: 4KZ2）几乎完全重叠。在50个发现的pRNA中，除Sarmo外，其余49个都能形成清晰的三向连接结构，且三维构象高度相似。这种结构保守性可能源于3WJ结构本身的高熔解温度（T_m）和低自由能（ΔG）特性，使其在进化过程中保持了稳定性。

系统进化分析展示了这些pRNA之间的亲缘关系。基于IQ-Tree构建的进化树显示，phi29与Sarmo pRNA之间的替换位点数值高达1.7，表明它们在序列水平上经历了显著分化，然而却保持着几乎相同的二级和三级结构。这种"序列变而结构不变"的现象正是进化压力作用的直接证据。

研究的讨论部分将发现提升到了生命起源的高度。作者指出，生命的本质特征在于运动，而生物ATP酶马达是维持这种运动的核心纳米机器。phi29 DNA包装马达中pRNA的广泛存在及其结构保守性，支持了"RNA世界"假说——RNA可能既是遗传信息载体又是化学反应的催化剂，在生命起源中扮演了核心角色。特别是phi29感染孢子形成细菌的特性，使其成为研究远古RNA功能的完美模型。

这项发表于《Non-coding RNA Research》的研究不仅发现了12种新型pRNA，更重要的是建立了一种基于结构保守性的RNA同源性识别方法。该方法克服了传统序列比对的局限性，为在浩瀚的基因组数据中寻找功能RNA元件提供了新思路。研究成果对理解RNA的进化与功能、追踪病毒起源、以及设计基于RNA纳米技术的疾病治疗方法都具有重要意义。

从技术层面看，研究团队主要运用了多种生物信息学和结构生物学方法：使用Infernal进行基于CM模型的RNA二级结构同源性搜索；采用Mfold预测RNA二级结构并通过ΔG值和3WJ特征进行筛选；应用AlphaFold3进行RNA三级结构预测并与已知晶体结构比对；通过Blastp验证共存马达蛋白的同源性；利用IQ-Tree构建系统进化树分析演化关系；结合体外病毒组装实验验证pRNA功能活性。

研究结果表明，ncRNA的进化在不同维度上呈现不同规律：一级序列快速变异，二级结构高度保守，三级结构极度保守。这种多维度的保守性模式为我们在分子水平追踪生命演化历程提供了新的视角和方法。正如作者在结论中所强调的："研究RNA序列和结构的保留、保守和变异模式，可以帮助我们追溯病毒的进化历史，寻找谱系信息，并提供关于病毒起源的重要线索。"这些发现不仅深化了我们对RNA世界假说的理解，也为RNA纳米技术的体内应用提供了理论基础。