突破组蛋白修饰质谱检测瓶颈：基于HiP-Frag的无限制搜索策略实现新型表观遗传标记的高通量鉴定

本研究针对组蛋白翻译后修饰（PTM）质谱分析中因计算限制难以全面识别非常见修饰的难题，开发了新型生物信息学流程HiP-Frag。通过整合开放搜索（OS）与精细化质量偏移搜索（DMO）策略，实现了对核心组蛋白和连接组蛋白H1中96个非常见修饰位点（含60个新位点）及55个H1修饰位点（含13个新位点）的高置信度鉴定，为表观遗传调控机制研究和疾病标志物发现提供了重要技术支撑。

　　

在表观遗传学研究中，组蛋白翻译后修饰（PTM）如同调控基因表达的“化学密码”，深刻影响着染色质结构和功能。尽管赖氨酸乙酰化（acetylation）和甲基化（methylation）已被广泛研究，但近年来发现的酰化（acylation）、糖化（glycation）等新型修饰逐渐揭示出更复杂的调控网络。然而，传统质谱（MS）分析方法受限于计算策略，往往只能识别常见修饰，大量非常见修饰如同“暗物质”般未被探索。这些未被识别的修饰可能与癌症等疾病密切相关——例如组蛋白乳酸化（lactylation）已被证明在肾细胞癌、结直肠癌和肝癌中促进转移和化疗耐药。如何突破技术瓶颈，全面解码组蛋白修饰图谱，成为表观遗传学领域亟待解决的关键问题。

为此，研究团队开发了名为HiP-Frag（Histone PTM analysis with FragPipe）的创新性生物信息学工作流。该工作流通过系统整合封闭搜索、开放搜索（OS）和精细化质量偏移搜索（DMO）策略，并采用分组错误发现率（FDR）控制和碎片离子匹配率过滤等严格质控手段，显著提升了非常见修饰的鉴定准确度。研究团队将HiP-Frag应用于九种人类癌细胞系的核心组蛋白数据和乳腺癌患者组织的连接组蛋白H1数据，这些样本经过PRO-PIC（丙酸酐-苯基异氰酸酯）等化学衍生化处理，并通过高分辨率 Orbitrap 质谱仪进行LC-MS/MS分析。

主要技术方法包括：1）基于FragPipe平台的MSFragger搜索算法，支持开放搜索和质量偏移搜索；2）组蛋白特异性样本制备流程（如ArgC酶切或化学衍生化）；3）合成肽段验证关键修饰位点；4）采用人类癌细胞系（如MDA-MB-231、MCF7）和临床乳腺癌组织（Luminal A与三阴性亚型）样本；5）通过靶向-诱饵数据库和分组FDR策略控制假阳性率。

研究结果

HiP-Frag工作流的优化与验证

通过系统评估开放搜索（OS）与精细化质量偏移搜索（DMO）的性能，研究发现传统OS策略虽能检测大量质量偏移，但难以区分生物学修饰与化学衍生物（如丙酰化propionylation）。HiP-Frag通过多轮迭代搜索（包括化学修饰物纳入、胰蛋白酶肽段处理和非组蛋白污染物排查），将修饰鉴定数量提升175倍。采用大肠杆菌（Escherichia coli）数据集进行的诱饵实验证实，分组FDR策略可将错误率控制在1%以下（图2）。此外，通过合成肽段验证了疑似位点（如H4K77丙酰化+喹啉修饰与丙二酰化的同量异位混淆），确保了结果可靠性。

核心组蛋白新型修饰的大规模发现

在核心组蛋白中共鉴定出96个修饰位点，涵盖14类修饰类型，其中60个为首次报道（图4）。甲酰化（formylation）、乳酸化（lactylation）和磷酸化（phosphorylation）为最富集的三种非常见修饰，而甘油酰化（glyceroylation）等糖化产物（AGEs）也显著存在。这些修饰广泛分布于H3.1、H4和H2A等组蛋白变异体，且与经典乙酰化/甲基化位点高度重叠，提示新型修饰可能通过竞争同一残基参与染色质调控。

连接组蛋白H1的修饰图谱拓展

在乳腺癌组织来源的组蛋白H1中鉴定出55个修饰位点（含13个新位点），其中甲酰化和乙酰化最为常见（图5）。值得注意的是，羧甲基化（carboxymethylation）和甲酰化在新型修饰中占比最高，且修饰位点分布于H1.2、H1.0等多种变异体的全局序列中，表明连接组蛋白同样存在复杂的PTM调控层。

研究结论与意义

HiP-Frag首次实现了对组蛋白PTM的“无限制搜索”，突破了传统封闭搜索的计算瓶颈，为全面解析表观遗传密码提供了强大工具。该研究不仅发现了60个核心组蛋白新修饰位点和13个H1新位点，更揭示了非常见修饰（如甲酰化、甘油酰化）的普遍存在性，挑战了当前仅基于乙酰化/甲基化的“染色质状态”定义。这些发现对理解癌症中Warburg效应导致的糖化修饰异常、染色质稳定性失调等机制具有重要启示。未来结合数据非依赖采集（DIA）技术和样本制备优化，HiP-Frag有望推动低丰度修饰的定量研究，为疾病表观遗传标志物发现和靶向治疗提供新方向。

论文发表于《Molecular & Cellular Proteomics》（注：期刊名称根据内容推断，原文未明确标注）。