一种来自Thermobacillus composti的新型且具有热稳定性的β-葡萄糖醛酸酶能够精确地将甘草苷水解为甘草酸

《Molecular Catalysis》：A novel and thermostable β-glucuronidase from Thermobacillus composti precisely hydrolyzes glycyrrhizin into glycyrrhetinic acid

基于热棒菌（Thermobacillus composti）的全基因组筛选，发现并表达纯化了一种新型高温稳定的β-葡萄糖苷酶（TcGUS）。该酶在35℃和pH 6.5条件下活性最高，50℃下半衰期达5天，其KM值为3.20 mM，最大催化效率151.18 μM·mg?1·min?1，具有独特的底物特异性，能高效将甘草酸（GL）水解为活性成分甘草次酸（GA）。研究为生物合成GA提供了高效稳定的酶源。

　　

魏仕宇|尤雅莉|王梓轩|冯丹彤|宋慈|王雅莉|赵嘉兴|杨艳|郑艳丽|李寅|郑王山|冷燕|田永强

兰州交通大学生物与制药工程学院，中国甘肃省兰州市730070

摘要

β-葡萄糖醛酸酶（GUS）可催化甘草苷（GL）中葡萄糖醛酸基团的水解，生成甘草酸（GA）。然而，β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的工业应用往往受到其稳定性差、水解活性低以及底物特异性不足的限制。本研究通过基因挖掘，从Thermobacillus composti中鉴定出一种新型且具有热稳定性的β-葡萄糖醛酸酶（TcGUS）。进化关系和序列分析表明，TcGUS属于典型的GUS酶家族。TcGUS表现出良好的底物特异性，能高效地将GL转化为GA，在35°C和pH 6.5条件下活性最高，在50°C时的半衰期为5天，显示出优异的热稳定性。TcGUS的K_m和V_max值分别为3.20 mM和151.18 μM·mg?1·min?1，反映了其高的底物选择性和生物转化效率。因此，TcGUS是合成甘草酸的一种有前景的生物催化剂。

引言

甘草（Glycyrrhiza spp）属于豆科植物，是一种多年生草本植物[1,2]。历史上，甘草数千年来一直被用作食物资源和药物。甘草苷（GL）是甘草中的水溶性成分[3,4]，是一种五环三萜皂苷，由两个葡萄糖醛酸单元通过β-1,2和β-1,3糖苷键与甘草酸（GA）连接而成。GL具有广泛的药理活性，包括抗菌、抗病毒、抗氧化和抗炎作用[5,6]。然而，需要注意的是，过量摄入GL可能导致高血压、水肿和心力衰竭等负面健康影响。GA是GL在体内的主要药理活性代谢物，其亲脂性使其在低浓度下也能发挥作用[7,8]。此外，GA还因其保湿、抗炎、清除自由基和改善皮肤弹性等特性而被用于化妆品和个人护理产品中[9,10]。

β-葡萄糖醛酸酶（GUS；EC 3.2.1.31）是一种关键酶，可催化糖苷化合物中葡萄糖醛酸基团的水解[11]。GUS促进GL水解，生成甘草酸单葡萄糖醛酸酯（GAMG）和GA[12,13]。该酶主要存在于糖苷水解酶（GH）家族1、2、30、79、154和GH-A中[12,13]。由于其重要的工业催化潜力，近年来对GUS酶的研究受到了广泛关注[14,15]。GUS活性已在多种生物体中被发现，包括细菌、真菌和动物；然而，不同来源的酶的降解特性差异很大[16,17]。GUS酶在作用于GL时表现出三种不同的水解模式：(i) GL → GAMG，(ii) GL → GAMG + GA，以及 (iii) GL → GA[18]。近年来，利用微生物GUS酶对GL进行生物转化取得了显著进展。然而，大多数已鉴定的酶只能将GL转化为GAMG或生成GAMG和GA的混合物。例如：Penicillium purpurogenum Li-3[19]、Streptococcus sp. LJ-22[20]、Aspergillus terreus Li-20[21]、Talaromyces pinophilus Li-93[22]和Chaetomium globosum DX-THS3[23]中的GUS。只有少数GUS酶能够高效直接将GL转化为GA，如Eubacterium sp. GLH[24]中的酶。尽管已在许多微生物中鉴定出β-葡萄糖醛酸酶，并对其酶学性质进行了部分研究，但关于热稳定型β-葡萄糖醛酸酶的报道仍然有限。研究人员[25,26]使用来自Penicillium purpurogenum Li-3的具有催化活性的β-葡萄糖醛酸酶进行GA合成。通过对蛋白质二级和三级结构的详细分析，优化了关键残基，提高了酶的热稳定性和pH稳定性。然而，尽管通过蛋白质工程进行了改进，该酶在极端条件下的催化活性仍受其固有敏感性的限制。

本研究利用NCBI数据库通过同源序列分析鉴定了一系列潜在的葡萄糖醛酸酶。选择来自Thermobacillus composti的葡萄糖醛酸酶基因进行进一步研究。通过基因工程技术（包括质粒的化学转化），将该基因插入pET28a蛋白表达载体中。使用SDS-PAGE和紫外分光光度法等分析方法测定了重组蛋白的分子量和浓度。然后通过HPLC检测并确认了葡萄糖醛酸酶及其水解产物的催化活性。这种新鉴定的酶被命名为TcGUS，为GA的高效合成提供了一种潜在的生物催化剂。

部分内容

GUS的基因挖掘

以先前报道的能有效催化GL转化为GA的葡萄糖醛酸酶AbGUS (KAE8374379.1)[27]为参考序列，通过UniProt-BLAST进行同源性分析，发现了来自多种生物来源的葡萄糖醛酸酶，其与AbGUS的序列相似度在40%到90%之间。其中，从Thermobacillus composti中鉴定出的葡萄糖醛酸酶（AGA59022.1）与AbGUS的序列相似度为46%，被命名为TcGUS。

结论

本研究成功纯化了来自Thermobacillus composti KWC4的β-葡萄糖醛酸酶（TcGUS），并对其进行了生化特性分析，发现其具有显著的GL水解为GA的特异性。基因组分析表明TcGUS属于糖苷水解酶家族2（GH2）的新成员，其GH2催化结构域存在多个突变。该酶具有优异的热稳定性和水解特异性。

材料与方法

材料。所有化学品和试剂均从Sigma-Aldrich（瑞典斯德哥尔摩）、Aladdin（中国北京）和Macklin（中国上海）购买。所有PCR试剂和酶均从Takara（中国大连）购买。

GUS的基因组数据挖掘。通过基因组挖掘构建了一个潜在β-葡萄糖醛酸酶库。从UniProt/Swiss-Prot数据库中选择了10种与AbGUS序列相似度在30%到90%之间的单加氧酶。

序列

遵守伦理标准

无

伦理声明

本文不包含任何作者参与的人类或动物实验。

CRediT作者贡献声明

魏仕宇：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、资金获取、数据分析、概念构建。尤雅莉：撰写 – 审稿与编辑、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。王梓轩：方法学设计、实验研究。冯丹彤：方法学设计、数据分析。宋慈：方法学设计、数据分析。赵嘉兴：结果验证、软件应用。杨艳：资金获取

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（32460620、32460091）、甘肃省青年科学基金（23JRRA1703、25JRRA958）、兰州交通大学天佑青年精英资助计划（1520260414、1520260501）以及目标支持计划下的大学合作伙伴联合研究与创新基金（LH2025007）的支持。