工程化P450BM3酶用于D-乙基孕二酮的高区域选择性和立体选择性C15α-羟基化反应

《Molecular Catalysis》：Engineering P450BM3 for highly regio- and stereoselective C15α-hydroxylation of D-ethylgonendione

本研究通过工程化P450BM3酶，实现了d-ethylgonendione的高效C15α-羟化，生成gestodene关键中间体。通过理性设计获得HG12M8突变体，选择性达89.5%，转化率90.1%，并解析了分子机制。

　　

余晓娟|张子丽|卢文龙|李倩|高成华|周策凡|唐静峰|郭志勇|李爱涛

湖北工业大学生命与健康科学学院，中国武汉430068

摘要

类固醇是重要的药理活性化合物，细胞色素P450单加氧酶（CYPs）作为类固醇药物合成的有前景的生物催化剂。然而，尽管它们具有显著的氧活化能力，但其应用往往受到催化效率低和区域选择性机制理解不完全的限制。在这项研究中，我们对P450BM3进行了工程改造，使其能够高效地实现d-乙基孕烯二酮的C15α-羟基化，从而产生广泛用于孕激素避孕药的戊酸雌二醇合成中的关键中间体。通过对实验室P450文库的初步筛选，我们发现了HG12变体（P450BM3/F87G/A328G/A330W），其区域选择性为54.1%，底物转化率为45.8%。随后通过针对活性口袋和底物通道周围残基的半理性设计，得到了HG12M8变体（R47W/F87G/M185L/A328G/A330W/T438G），其区域选择性达到89.5%，底物转化率为90.1%。分子动力学模拟显示，F87G和M185L突变减轻了空间阻碍并稳定了底物结合，而R47W则拓宽了底物进入通道。这项工作提出了一种双用途蛋白质工程策略，以克服P450s在效率和选择性方面的挑战，同时提供了一种用于可持续类固醇药物生产的强大生物催化剂。

引言

类固醇是全球第二大销售量的药物类别，仅次于抗生素。它们广泛的治疗应用包括抗炎、抗过敏、抗感染和内分泌调节功能，因此在治疗炎症、呼吸系统疾病和激素失衡方面具有临床价值[[1], [2], [3], [4]]。类固醇药物的药效特异性本质上是由战略性的功能化决定的，其中微妙的区域化学和立体化学修饰会深刻影响受体结合亲和力和代谢稳定性[[5], [6], [7]]。因此，在合成化学中实现功能基团的区域和立体选择性安装仍然是一个持续的挑战[[8], [9], [11]]。

戊酸雌二醇是由Schering AG于1975年开发的第三代合成孕激素，在临床中得到广泛应用[12]。传统的戊酸雌二醇生产过程包括将雌酮3-甲基醚进行17-酮烯化，随后通过钯醋酸盐催化脱氢并发生双键迁移形成C15,16双键，产率约为30%（图1A）[13]。此外，从d-乙基孕烯二酮开始，使用m-氯过苯甲酸（mCPBA）将其16β-苯基硒基氧化为苯基硒酰基，最后在二乙胺作用下消除该基团，得到C15,16-烯酮结构，产率约为53%（图1B）[13]。这些多步骤过程需要大量的保护基团操作，导致合成复杂性和环境负担较高（图1），这促使人们探索可持续的生物催化方法。

利用细胞色素P450单加氧酶的生物催化在类固醇功能化方面具有明显优势，能够在绿色反应条件下实现位点选择性的羟基化，并具有出色的原子经济性。对于戊酸雌二醇的合成，探索了一种混合化学酶法，首先对d-乙基孕烯二酮进行C15α-羟基化，然后脱水生成C15/C16双键，再通过后续化学合成得到最终产品，产率为21%（图1C）[12]。然而，在此过程中，野生型真菌Penicillium raistrickii中的P450被用作C15α-羟基化的催化剂，但其底物负荷低（2 g/L）和产率中等（65%），导致整体产率较低[14]。尽管已经鉴定出负责Penicillium raistrickii中C15羟基化的关键P450酶（P450pra）并将其异源表达在Pichia pastoris中，但其催化效率低（约20%转化率）、选择性不佳（约80%）和产率较低（15%）[15]，限制了进一步的工业放大。这种性能不佳可能是由于真菌P450s是膜结合蛋白，难以异源表达[[16], [17], [18]]。

相比之下，细菌P450s是可溶性酶，可以高产率表达，从而实现显著的生物转化活性。据报道，来自Bacillus megaterium的P450BM3和CYP106A2变体可以催化睾酮和雄烯二酮的C15-羟基化[[19], [20], [21]]。然而，尚未有细菌P450被报道能够特异性地在C15α位置对d-乙基孕烯二酮进行羟基化。蛋白质工程的最新进展现在促进了位点选择性的类固醇羟基化[[22], [23], [24]]，强调了需要多功能平台来实现高精度氧化并提高立体选择性。鉴于细菌酶的优越可操作性，发现一种能够对d-乙基孕烯二酮进行C15α-羟基化的细菌P450（或其变体）是一个关键的未满足需求。

在这项研究中，我们首先通过文库筛选鉴定了一个对d-乙基孕烯二酮具有C15α-羟基化活性的P450BM3变体。然后采用结构引导的半理性设计系统地提高了催化性能。最后，通过计算分析阐明了P450BM3及其变体之间不同的催化机制，为区域选择性和立体选择性的决定因素提供了见解。

材料

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH或NADP⁺）购自Bontac（中国深圳）。异丙基β-d-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG，>99%）和卡那霉素二硫酸盐（>99%）购自Sangon（中国上海）。STAR Max DNA聚合酶和限制酶Dpn I购自Takara（中国上海）。KOD Neo DNA聚合酶购自TOYOBO（中国上海）。T5外切核酸酶购自New England Biolabs（美国马萨诸塞州贝弗利）。葡萄糖

筛选P450BM3变体文库

为了实现d-乙基孕烯二酮在C15α位置的高效选择性羟基化，我们对一个包含48种P450酶及其变体的实验室文库进行了筛选。初步筛选发现了九种具有催化活性的变体（图2A和表S1），其中三种P450BM3变体能够在C15α位置对d-乙基孕烯二酮进行羟基化。值得注意的是，GV变体（A74G/F87V/A184I/I263G/A264G/A328G）的转化率为47.7%，C15α选择性为16.5%。

结论

总结来说，我们通过结构引导的优化工程改造了一种C15α区域选择性的P450BM3变体。通过重塑底物结合口袋，HG12M5变体（F87G/A328G/A330W/T438G/M185L）对d-乙基孕烯二酮的C15α选择性达到了90.3%（比模板HG12高1.7倍）。随后的底物通道工程得到了HG12M8变体（R47W/F87G/M185L/A328G/A330W/T438G），其活性比HG12M5高3.5-4.5倍，同时保持超过89%的选择性。

CRediT作者贡献声明

余晓娟：撰写——原始草稿、软件、方法学、数据分析。张子丽：撰写——原始草稿、验证、软件、研究。卢文龙：撰写——审阅与编辑、验证、软件、研究。李倩：撰写——审阅与编辑、验证、软件、数据分析。高成华：撰写——审阅与编辑、验证、软件、数据分析。周策凡：撰写——原始草稿、验证、监督、软件、数据分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2024YFA0917800）、武汉市自然科学基金（2024040701010046）、湖北省学科人才引进创新基地（编号2019BJH021）、国家生物催化与酶工程重点实验室研究计划以及中国博士后科学基金（2024M750847）的支持。