靶向S100A8的CRISPR-Cas9纳米递送系统通过调控JAK/STAT3通路促进骨关节炎治疗

本研究针对骨关节炎（OA）治疗中基因编辑技术面临的递送效率低、靶向性差和安全性不足等问题，开发了一种新型多功能纳米载体PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt。该系统通过aptamer介导的滑膜细胞特异性靶向，实现了S100A8基因的高效敲除（64.4%），有效抑制JAK/STAT3信号通路，减轻滑膜炎和软骨降解，为OA的精准基因治疗提供了新策略。

　　

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）作为一种常见的退行性关节疾病，严重影响患者的生活质量。其病理特征包括滑膜炎、软骨降解和软骨下骨改变。目前临床治疗手段如非甾体抗炎药、关节腔注射糖皮质激素或手术干预等，仅能缓解症状，无法逆转疾病进程。炎症因子在OA发展中起着关键作用，其中S100A8作为一种重要的炎症介质，在OA滑膜组织中显著上调，可能通过激活JAK/STAT3信号通路促进炎症反应和软骨破坏。然而，如何实现S100A8的特异性靶向干预并提高治疗安全性，仍是当前研究的难点。

基因编辑技术尤其是CRISPR/Cas9系统的发展为OA治疗提供了新思路，但其临床应用仍面临诸多挑战，包括递送效率低、编辑效果短暂、体内快速清除以及潜在的脱靶效应等。传统的递送载体如聚酰胺-胺（PAMAM）树枝状大分子虽然能有效结合核酸分子，但存在细胞毒性高、缺乏靶向性等问题。因此，开发一种高效、安全且具有细胞特异性的CRISPR/Cas9递送系统，对于推进OA的基因治疗具有重要意义。

在这项发表于《Materials Today Bio》的研究中，研究人员通过整合RNA生物信息学和滑膜蛋白质组学分析，发现S100A8是OA进展中持续激活JAK/STAT3通路的关键介质。基于这一发现，团队设计了一种新型纳米载体系统PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt。该系统以PAMAM-PLGA（PP）共聚物为核，静电结合Cas9-S100A8复合物，并封装于aptamer修饰的PLGA壳结构中，最终形成具有滑膜细胞靶向功能的纳米微粒。

研究采用的主要技术方法包括：通过iTRAQ标记和LC-MS/MS进行蛋白质组学分析筛选关键靶点；利用CRISPR/Cas9系统构建S100A8基因编辑载体；合成PAMAM-PLGA共聚物并通过核磁共振氢谱（¹H NMR）验证其结构；采用O/W乳液法制备PLGA微球并进行表面aptamer功能化；通过动态光散射（DLS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和扫描电子显微镜（SEM）对纳米颗粒进行表征；使用流式细胞术和共聚焦显微镜评估细胞摄取和胞内定位；通过蛋白质印迹（Western blot）和免疫组化分析蛋白表达；利用微CT和步态分析评估体内治疗效果。人类滑膜组织样本来源于关节镜手术患者，动物实验使用C57小鼠ACLT模型。

3.1. 人正常和OA滑膜中蛋白质谱和重叠基因表达的比较分析

通过整合GSE82107数据库的转录组数据和实验蛋白质组学分析，鉴定出13个OA相关共同基因，S100A8是其中显著上调的关键分子。免疫组化和Western blot结果证实S100A8在OA滑膜中表达显著升高。

3.2. S100A8的差异表达及JAK/STAT3通路在人OA滑膜中的激活

S100A8在OA滑膜组织中表现出强烈的免疫反应性，其表达显著高于对照组。GO分析显示S100A8富集于炎症和免疫通路，实验证实S100A8沉默可抑制IL-6诱导的JAK/STAT3磷酸化，表明S100A8是JAK/STAT3信号通路的上游调控因子。

3.3. 通过T7内切酶I检测验证CRISPR-Cas9介导的S100A8基因编辑效率

采用T7内切酶I assay评估5种crRNA的编辑效率，结果显示crRNA 1、2和3能有效编辑目标DNA，最终选择crRNA 1用于后续研究。

3.4. PAMAM-PLGA（PP）共聚物的合成与验证

通过将PLGA-COOH与NH₂-PAMAM G3共轭合成PP共聚物，¹H NMR证实成功共聚，接枝效率为73.76%。该共聚物具有增强的胶体稳定性和降低的细胞毒性。

3.5. PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt MPs的表征

纳米颗粒制备过程包括Cas9-S100A8复合物的核心封装、PLGA包覆和aptamer表面偶联。Zeta电位监测显示表面电荷变化，FTIR和SEM证实颗粒结构和形态。琼脂糖凝胶阻滞实验显示PP共聚物在1:10比例下实现完全核酸阻滞。

3.6. PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt MPs对滑膜细胞的功能影响

共聚焦显微镜显示纳米颗粒特异性被滑膜细胞摄取。溶酶体共定位研究表明纳米颗粒能实现内体逃逸。流式细胞术显示浓度依赖性摄取，0.8 μg/mL时达到98.8%的摄取率。划痕实验和Transwell实验表明该纳米颗粒能抑制滑膜细胞迁移。细胞毒性实验显示纳米颗粒保持80%以上的细胞活力。

3.7. PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt MPs的体外和体内生物利用度

FAM标记追踪显示该纳米颗粒在24小时达到64.39%的摄取效率，48小时仍保持71.46%。体内荧光成像显示纳米颗粒在关节内保留96小时，表明其具有持续的治疗潜力。

3.8. PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt MPs治疗后小鼠OA模型炎症标志物和骨赘形成的纵向分析

免疫组化分析显示，纳米颗粒治疗后S100A8、JAK和STAT3表达显著降低。微CT分析显示纳米颗粒显著减轻骨赘形成。Western blot分析显示治疗后期S100A8、JAK、STAT3和MMP13表达显著抑制。

3.9. 通过PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt MPs治疗对软骨稳态和软骨下骨密度的治疗性调节

OARSI评分显示纳米颗粒减轻软骨降解。免疫荧光显示Aggrecan和Collagen II表达增加，MMP13表达减少。微CT显示软骨下骨密度和骨小梁厚度逐渐恢复正常。

3.10. ACLT和PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt治疗后软骨下骨中修复型H型血管通道和步态分析

免疫荧光显示纳米颗粒恢复H型血管密度。步态分析显示治疗显著改善小鼠步长，减轻跛行。

研究结论与讨论部分表明，S100A8是OA发病机制中的核心介质，CRISPR-Cas9介导的S100A8基因沉默表现出强大的抗炎和软骨保护作用。设计的PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt微粒代表了基因编辑递送领域的范式转变，将PAMAM树枝状大分子的核酸浓缩能力与PLGA的生物降解性和aptamer介导的滑膜靶向相结合。这种逐层设计在滑膜细胞中实现了64.39%的转染效率，同时通过表面电荷调节保持内体逃逸增强和80%以上的细胞活力。该制剂通过调节JAK/STAT3信号通路，有效减轻了OA的滑膜炎、软骨退化、软骨下骨紊乱和步态障碍。

这些发现不仅验证了CRISPR-Cas9介导的S100A8消融的治疗效果，还重申了其作为OA发病机制中炎症级联调控的关键分子枢纽的作用，将其定位为炎症性关节病的关键调控节点。然而，研究也存在一些局限性，包括基因编辑的不完全性、细胞类型选择性的挑战以及物种差异对临床 extrapolation 的限制。该研究的转化潜力需要通过严格的临床测试来确保人类患者的安全性、有效性和治疗相关性。

总之，这项研究通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑阐明了S100A8在OA中的作用，证明了这种治疗干预的潜力。PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt递送系统的使用显示出有希望的结果，包括滑膜靶向特异性、降低的细胞毒性和提高的编辑效率，这些对于减轻OA相关炎症和退化至关重要。这项研究增强了治疗潜力，并为治疗OA和相关炎症性疾病的精准医学提供了新的见解。