靶向S100A8的CRISPR-Cas9@PLGA-适配体微粒通过调控JAK/STAT3通路减轻骨关节炎软骨降解和软骨下骨异构

本研究针对骨关节炎（OA）治疗中基因编辑技术靶向性差、细胞毒性高和递送效率低等问题，开发了新型PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt微粒系统。通过整合生物信息学分析和蛋白质组学筛选发现S100A8是OA关键炎症介质，利用CRISPR-Cas9技术特异性敲除S100A8基因，并采用PAMAM-PLGA核壳结构搭载适配体实现滑膜细胞靶向递送。实验证明该系统具有64.4%的基因敲除效率、71.5%的mRNA缓释能力和98.8%的细胞靶向摄取率，显著抑制JAK/STAT3通路活化，减轻滑膜炎、软骨降解和骨赘形成，为OA基因治疗提供了安全高效的新策略。

　　

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）作为一种常见的退行性关节疾病，严重影响患者的生活质量，其典型特征包括关节疼痛、僵硬和功能受限。滑膜炎症在OA进展中扮演关键角色，会导致关节肿胀、局部发热和压痛，最终引发不可逆的关节软骨和软骨下骨退化。目前OA的治疗方法包括运动、类固醇注射以及使用非甾体抗炎药（NSAIDs）或疾病修饰抗风湿药（DMARDs）等抗炎药物。当保守治疗无效时，可能需要进行滑膜切除术或关节置换手术，但这些手术存在出血、术后疼痛、感染以及深静脉血栓（DVT）等风险。因此，开发有效且安全的新型治疗策略迫在眉睫。

基因编辑技术尤其是CRISPR/Cas9的出现为OA治疗带来了新希望，它可以靶向病理基因如MMP13和IL-1β，从而减轻疼痛并延缓关节 deterioration。然而，该技术的临床转化受到基因递送效率低、编辑效果短暂以及体内快速清除等问题的限制。此外，常用的递送载体如聚酰胺胺（PAMAM）树枝状大分子虽然能提高CRISPR/Cas9组分的递送效率，但存在细胞毒性、免疫原性反应、RNA保护不足以及非特异性靶向导致脱靶遗传修饰的风险。为了克服这些挑战，研究人员通过表面修饰策略，例如用聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）分子中和表面电荷，以降低细胞毒性，并利用PLGA的可生物降解性和缓释特性优化基因递送载体。然而，PAMAM-PLGA（PP）微粒缺乏特异性靶向能力，可能影响药物递送至预期病理部位，从而削弱治疗效果，甚至导致不良反应和治疗剂浪费。

为了识别OA治疗的潜在基因靶点，本研究通过整合OA滑膜组织的蛋白质组学分析和GEO数据库（GSE82107）的转录组数据，发现S100A8是OA中持续显著上调的关键基因。既往研究已证实S100A8是OA中重要的促炎介质，可促进滑膜炎和软骨退化。因此，研究人员选择S100A8作为治疗靶点，并开发了一种新型多功能纳米载体——PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt微粒，旨在实现滑膜细胞特异性靶向、增强内化能力并减少细胞毒性。

该研究发表于《Materials Today Bio》，为了开展上述研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：通过整合RNA生物信息学和滑膜蛋白质组学分析确认S100A8在OA进展中的作用；利用CRISPR/Cas9技术合成靶向S100A8的基因编辑系统；开发PAMAM-PLGA共聚物（PP）并封装Cas9-S100A8复合物，最后通过适配体修饰实现滑膜特异性靶向；采用体内外实验评估微粒的递送效率、细胞毒性、基因敲除效果及治疗作用，包括细胞迁移实验、细胞毒性测定、Western blot、免疫组化、微CT扫描和步态分析等；使用ACLT（前交叉韧带横断）小鼠模型模拟OA，并进行长期疗效观察。

3.1. 正常和OA人滑膜蛋白质谱及重叠基因表达的比较分析

通过蛋白质组学分析结合GSE82107数据库的转录组数据，研究人员发现S100A8在OA滑膜中显著上调，是13个重叠基因中的关键介质。免疫组化和Western blot结果进一步证实S100A8在OA滑膜中的高表达，凸显其作为治疗靶点的潜力。

3.2. S100A8的差异表达及JAK/STAT3通路在人OA滑膜中的激活

免疫组化显示S100A8在OA滑膜组织中具有强烈的免疫反应性，表达显著高于对照组。Western blot分析验证了S100A8在OA滑膜中的升高，并通过GO分析发现S100A8富集于炎症和免疫通路，尤其是JAK/STAT3通路，表明其作为OA上游调节分子的关键作用。

3.3. 通过T7内切酶I assay验证CRISPR-Cas9介导的S100A8基因编辑效率

利用T7内切酶I assay评估5种crRNAs的编辑效率，发现crRNA 1、2和3能有效编辑目标DNA，因此选择crRNA 1用于后续核心CRISPR-Cas9系统的合成。

3.4. PAMAM-PLGA（PP）共聚物的合成与验证

为降低PAMAM的细胞毒性，研究人员通过EDC/NHS化学将PLGA-COOH与NH2-PAMAM G3结合，形成PP共聚物。核磁共振氢谱（¹H NMR）证实了共聚物的成功合成，且该共聚物具有增强的胶体稳定性和较高的接枝效率。

3.5. PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt微粒的表征

微粒的合成过程包括核心封装、PLGA包覆和适配体表面偶联。Zeta电位测量显示表面电荷的变化证实了核酸复合物的成功形成。FTIR光谱和SEM成像显示微粒结构均匀，凝胶阻滞实验表明PP共聚物在1:10比例下能完全阻滞mRNA迁移。释放动力学显示PP核芯能持续释放mRNA超过8天。

3.6. PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt微粒对滑膜细胞的功能影响

共聚焦显微镜显示微粒特异性被滑膜细胞内化，而软骨细胞、半月板细胞和HepG2细胞仅显示微弱荧光。溶酶体共定位研究表明微粒能实现内体逃逸。流式细胞术显示微粒在0.8 μg/mL浓度下能达到98.8%的细胞摄取率。划痕实验和Transwell迁移实验表明微粒能显著降低滑膜细胞的迁移能力。细胞毒性实验显示微粒能维持80%以上的细胞存活率。

3.7. PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt微粒的体外和体内生物利用度

体外实验显示FAM标记的微粒在24小时达到64.39%的摄取效率，48小时仍保持71.46%的保留率。体内荧光成像显示微粒在关节内注射96小时后仍保持较高的荧光强度，表明其具有持续的治疗递送潜力。

3.8. 经PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt微粒治疗后小鼠OA模型炎症标志物和骨赘形成的纵向分析

免疫组化分析显示，微粒治疗后S100A8、JAK和STAT3的表达在2周时升高，但在4至16周逐渐下降，表明滑膜炎受到抑制。微CT分析显示微粒能显著减轻骨赘形成，Western blot证实治疗后期S100A8、JAK、STAT3和MMP13的表达显著降低。

3.9. 通过PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt微粒治疗调节软骨稳态和软骨下骨密度

OARSI评分显示微粒能缓解软骨退化，免疫荧光显示Aggrecan和Collagen II表达上调，MMP13表达下降。微CT显示软骨下骨密度（BV/TV ratio）和骨小梁厚度（Tb.Th.）逐渐恢复正常，表明治疗能促进骨重建。

3.10. ACLT和PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt治疗后软骨下骨中H型血管通道的恢复和步态分析

免疫荧光显示微粒能恢复H型血管密度，步态分析表明治疗能显著改善步长，减轻OA小鼠的跛行。

本研究通过CRISPR-Cas9技术成功敲除S100A8基因，并开发出新型PP-Cas9-S100A8@PLGA-apt微粒递送系统，实现了滑膜细胞特异性靶向、高效基因编辑和缓释效果。实验证明该系统能显著抑制JAK/STAT3通路活化，减轻滑膜炎、软骨降解和骨赘形成，改善关节功能。该研究不仅验证了S100A8作为OA治疗关键靶点的潜力，还为基因治疗在OA及其他炎症性疾病中的应用提供了新思路，具有重要的临床转化价值。然而，研究仍存在一些局限性，如基因敲除的不完全性、靶向绝对特异性的挑战以及物种差异可能限制临床 extrapolation，未来需要进一步优化技术和开展临床验证。