靶向PD-L1的IL-12融合蛋白工程化CAR-T细胞增强实体瘤治疗安全性与疗效

本研究针对CAR-T细胞在实体瘤中疗效受限的难题，创新性地开发了分泌双功能融合蛋白（αPD-L1-IL-12）的工程化CAR-T细胞。通过将PD-L1阻断与IL-12局部递送相结合，该策略显著提升了CAR-T细胞的抗肿瘤活性与安全性，在前列腺癌和卵巢癌模型中实现100%治愈率，并有效降低系统毒性，为实体瘤免疫治疗提供了突破性解决方案。

　　

实体肿瘤治疗领域，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法虽在血液肿瘤中取得显著成效，却始终难以突破实体瘤的壁垒。这主要归因于免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的多重阻碍：T细胞向肿瘤部位的归巢能力受损、T细胞耗竭现象频发、细胞持久性不足，以及难以有效调动内源性抗肿瘤免疫应答。尽管联合使用免疫检查点抑制剂（ICIs）（如αPD-1、αCTLA-4和αPD-L1）或免疫调节因子（如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和αTGFβ）等策略被广泛探索，但在“免疫学冷”肿瘤（如转移性去势抵抗性前列腺癌、卵巢癌和胰腺癌）中反应率依然有限。此外，这些组合疗法还面临着递送效率低、生物分布不理想和系统毒性强等多重挑战。

在此背景下，John P. Murad等研究人员在《Nature Biomedical Engineering》上发表了一项开创性研究。他们设计了一种新型CAR-T细胞，可分泌一种双功能融合蛋白，将靶向PD-L1的单链可变片段（scFv）与免疫调节细胞因子（如IL-12）结合。其核心假设是：利用CAR-T细胞作为特洛伊木马，将融合蛋白精准递送至肿瘤局部，一方面通过αPD-L1阻断免疫抑制信号，另一方面通过IL-12等细胞因子激活局部免疫反应，从而在提高疗效的同时，将细胞因子的毒性作用限制在肿瘤内，避免严重的全身性副作用。

为验证这一设想，研究团队开展了一系列严谨的实验。本研究主要运用的关键技术方法包括：利用逆转录病毒载体构建表达靶向PSCA或TAG72的CAR及各种双功能融合蛋白（如αPD-L1-IL-12）的工程化T细胞；通过体外共培养实验、重复肿瘤挑战实验和PD-L1结合/阻断实验评估T细胞功能与蛋白结合活性；建立免疫活性小鼠模型（皮下前列腺癌模型和腹腔卵巢癌模型）进行体内安全性与疗效评价；采用流式细胞术、ELISA、免疫组化（IHC）及Nanostring GeoMx空间蛋白质组学等技术深度解析肿瘤微环境的变化。

CAR-T细胞分泌双功能融合蛋白并体外展示PD-L1结合与细胞因子调节功能

研究人员首先成功构建了能分泌多种双功能融合蛋白（如αPD-L1-TGFβtrap、αPD-L1-IL-15和αPD-L1-IL-12）的 murine PSCA-CAR T细胞。

体外实验证实，这些融合蛋白能有效结合由条件培养基诱导表达的肿瘤细胞表面PD-L1，并竞争性抑制其检测信号（MFI降低）。在重复肿瘤攻击实验中，携带IL-12或IL-15融合蛋白的CAR-T细胞展现了持续且近乎完全的肿瘤细胞杀伤能力，其中IL-12融合蛋白更能诱导 sustained IFNγ分泌、高表达4-1BB和TIM-3（IL-12信号的下游靶标），表明其能显著增强T细胞活化。

携带αPD-L1-IL-12融合蛋白的CAR-T细胞在同源 murine 癌症模型中展示出安全且持久的抗肿瘤反应

在体内前列腺癌模型中，与仅接受CAR-T细胞或携带其他融合蛋白（如αPD-L1-IL-15或αPD-L1-TGFβtrap）的细胞相比，接受PSCA-CAR/αPD-L1-IL-12 T细胞治疗的小鼠实现了100%的肿瘤消除，且无显著体重下降，显示出卓越的安全性。重要的是，其疗效优于非PD-L1结合的控制组（αPD-L1mut-IL-12），后者引起了显著的全身性毒性（体重下降）和更高的系统IFNγ水平。流式细胞分析进一步揭示，αPD-L1-IL-12组小鼠循环髓系细胞中PD-L1表达降低，表明融合蛋白实现了预期的局部结合与阻断效应。

携带αPD-L1-IL-12的TAG72-CAR-T细胞在同源 murine 卵巢癌模型中促进持久抗肿瘤反应并展示肿瘤限制性效应

在腹腔卵巢癌转移模型中，TAG72-CAR/αPD-L1-IL-12 T细胞治疗同样取得了显著成效，其抗肿瘤反应强烈且持久，导致100%的存活率。相比之下，αPD-L1mut-IL-12控制组疗效不均且生存率降低。值得注意的是，该模型中所有治疗组小鼠体重变化均微小，提示局部（腹腔）给药有助于进一步控制毒性。对肿瘤局部免疫细胞的分析显示，αPD-L1-IL-12组瘤内IFNγ分泌显著升高，CAR-T细胞浸润增多，且髓系细胞PD-L1表达下降，再次证明了其局部作用机制。

携带αPD-L1-IL-12融合蛋白的CAR-T细胞引发肿瘤微环境的显著改变

通过Nanostring GeoMx空间蛋白质组学技术对肿瘤组织进行深度分析发现，与对照组相比，αPD-L1-IL-12治疗组的肿瘤区域显示出淋巴细胞（CD3ε、CD4、CD8α）、T细胞活化标志物（CD28、穿孔素）及免疫检查点分子（如VISTA）的显著富集。同时，该组还表现出抑制性M2样髓系标志物CD163的减少和MHC Class II表达的升高，表明TME从免疫抑制状态向免疫活化状态发生了重编程。相关性分析进一步揭示了CD8α T细胞与CD28、VISTA表达之间的强正相关，以及穿孔素与CD163的负相关，从空间层面证实了αPD-L1-IL-12能有效促进抗肿瘤免疫并重塑免疫抑制微环境。

与联合给药相比，工程化分泌αPD-L1-IL-12的CAR-T细胞安全性更佳

研究的关键优势在于其“all-in-one”的工程化策略。与将CAR-T细胞与外源性αPD-L1抗体（Avelumab）和可溶性IL-12（sIL-12）联合给药的传统方法相比，工程化分泌αPD-L1-IL-12的CAR-T细胞在保持强劲抗肿瘤疗效的同时，显著降低了系统性和腹腔局部炎症因子（如IFNγ、IL-12、IL-6、IL-10、CXCL10、MIP1α）的水平，避免了联合给药引发的脾肿大和潜在细胞因子释放综合征（CRS）风险，证明了其卓越的安全性。

人源CAR-T细胞工程化分泌人源双功能αPD-L1-Fc-hIL-12融合蛋白并展示体外功能活性提升

最后，研究团队成功构建了人源版本的双功能融合蛋白（αPD-L1-Fc-hIL-12）。体外实验证实，由工程化人Jurkat T细胞或原代人TAG72-CAR T细胞分泌的该融合蛋白能有效结合人肿瘤细胞（PC3、PEO4-STn）表面的PD-L1，并呈现IL-12活性。在共培养实验中，携带αPD-L1-Fc-hIL-12的CAR-T细胞展现出增强的肿瘤细胞杀伤能力、更高的细胞扩增水平、提升的活化标志物CD25表达以及增加的IFNγ分泌，同时降低了肿瘤细胞和T细胞表面的PD-L1表达，为后续临床转化提供了坚实的理论与实验基础。

结论与意义

本研究成功地开发了一种极具临床应用前景的实体瘤免疫治疗新策略。通过巧妙的工程设计，让CAR-T细胞自身分泌一种兼具PD-L1阻断和IL-12局部递送功能的双功能融合蛋白，实现了“肿瘤局部免疫调节”的精准医疗理念。该策略不仅显著提升了CAR-T细胞在两种挑战性实体瘤（前列腺癌和卵巢癌）模型中的疗效和持久性，更重要的是，通过将强大的免疫刺激剂IL-12锚定在PD-L1高表达的肿瘤区域，有效避免了其系统性暴露所带来的严重毒性，大大提高了治疗的安全性窗口。

其重要意义在于：第一，为解决CAR-T细胞在实体瘤中面临的TME抑制和毒性管理两大核心难题提供了协同解决方案；第二，展示了细胞疗法作为“活药物工厂”进行局部递送的独特优势，优于传统联合给药的药代动力学特性；第三，研究中所验证的人源版本融合蛋白为其向临床试验的过渡铺平了道路；第四，该平台技术具有广泛的适用性，可扩展至其他细胞疗法（如CAR-NK、CAR-巨噬细胞）及其他需要免疫调节的实体瘤类型。这项研究为下一代更安全、更有效的实体瘤细胞免疫疗法树立了新的标杆。