基于三标记α-酮异戊酸与UCBShift 2.0整合的HMBC-CC-HMQC NMR新策略在甲基归属研究中的突破性应用

本研究针对大蛋白甲基信号归属难题，开发了一种集成选择性同位素标记、新型HMBC-CC-HMQC脉冲序列与UCBShift 2.0化学位移预测的创新策略。通过合成(2-13C,3-甲基-13C,4-13C,3-2H)α-酮异戊酸前体，成功实现缬氨酸/亮氨酸残基偕二甲基与骨架原子的相干转移，在134 kDa超大蛋白体系中获得65%的甲基关联信号，结合人工智能预测实现90%以上的正确归属率，为结构生物学研究提供了强大工具。

　　

在结构生物学领域，甲基基团作为研究大分子系统的强大探针备受关注。它们不仅均匀分布在蛋白质结构中，其化学位移能够灵敏反映局部化学环境的变化、结合位点映射以及侧链构象信息。更重要的是，利用甲基三重旋转轴的快速运动特性，横向弛豫优化(TROSY)脉冲序列通过HMQC型相关实验展现了在大型蛋白质及其组装体研究中的巨大潜力，而这些体系往往难以通过传统的骨架导向方法进行研究。

然而，尽管过去取得了显著进展，甲基共振信号的序列归属问题仍然制约着大蛋白应用的发展。虽然已有多种解决方案被提出，包括通过点突变逐个替换甲基残基的生物化学方法，以及基于NOESY光谱距离信息和已知蛋白质三维结构的光谱策略，但这些方法仍面临巨大挑战。特别是当从零开始时，基于NOESY的方法需要处理大量可能的分配配置，其数量随着甲基组数N呈阶乘级增长，即使对中等大小的蛋白质也难以实现无偏分析。

正是在这样的背景下，研究人员开展了一项创新性研究，通过整合选择性前体标记、新型脉冲序列和化学位移预测技术，开发了一套完整的甲基归属方案。该研究成功合成了一种新型同位素标记前体——(2-¹³C,3-甲基-¹³C,4-¹³C,3-²H)α-酮异戊酸，并基于此设计了3D SOFAST HMBC-CC-HMQC脉冲序列，能够同时连接缬氨酸和亮氨酸残基的偕二甲基彼此之间以及与蛋白质骨架的联系。

研究采用了多技术整合的方法策略：首先通过化学合成获得特异性同位素标记的前体化合物；利用大肠杆菌表达系统制备了三种不同大小的模型蛋白——15 kDa的人源BRD4-BD1、60.2 kDa的人源Tom70胞质域以及134 kDa的Ignicoccus islandicus苹果酸 dehydrogenase四聚体；使用800 MHz核磁共振谱仪采集了SOFAST HMBC-HMQC、SOFAST HMBC-CC-HMQC以及BEST-HNCACB等实验数据；最后通过UCBShift 2.0人工智能算法进行化学位移预测和自动归属。

在新型前体合成与表征方面，研究团队改进了Lichtenecker等人的合成路线，以2-¹³C-甘氨酸为起始原料，通过与1,3-¹³C₂-丙酮缩合制备异亚丙基乙内酰脲同位素类似物，再经碱性水解和氘代处理成功获得目标化合物。每25毫克产品的材料成本控制在30欧元左右，体现了该方法的实用性和经济性。

关于脉冲序列设计与优化，研究人员在原有3D HMBC-HMQC基础上进行了重要扩展。新设计的3D SOFAST HMBC-CC-HMQC序列在HMBC模块后插入了一个¹³C-¹³C相干转移步骤，使亮氨酸残基的相干能够进一步转移到C^α位置。通过调整传输延迟为1/(4¹J_CαCβ) = 7.2 ms，实现了原位和反相位相干的均衡分布，为第一个间接演化时间t₁期间的检测保留了这两个组分。

在应用性能评估部分，研究在三个不同大小的蛋白质系统上验证了方法的有效性。对于15 kDa的BRD4-BD1，结合可用的骨架分配和BEST-HNCACB，成功归属了5/5缬氨酸和5/13亮氨酸甲基基团。在134 kDa的四聚体苹果酸 dehydrogenase中，二维HMQC光谱检测到112个甲基信号，其中73个(65%)检测到多个相关峰，仅25%的甲基未检测到交叉峰，这些位点已知存在毫秒时间尺度的交换过程。对于60.2 kDa的Tom70，尽管灵敏度更具挑战性，但仍能明确连接大量{C_α,C_γ1,2,C_γ2,1,H_γ2,1}(缬氨酸)和{C_β,C_δ1,2,C_δ2,1,H_δ2,1}(亮氨酸)自旋系统。

在转移效率分析中，研究人员通过理论模拟和实验验证了新旧前体的传输效率差异。模拟结果显示，在没有弛豫的情况下，新前体的振幅约为旧前体的四分之一(0.25)，但随着弛豫加快，这种相对差异变得不那么明显(在R₂=30 s^-1时约为80%)。实验数据与计算结果吻合良好，非选择性实验中的峰强度约为70-80%。

最重要的结构基础分配策略部分展示了UCBShift 2.0的强大功能。研究采用加权均方根误差(RMSE)度量对候选分配进行排名，权重选择反映了每个核的化学位移范围——分散较宽的核(如¹⁵N)分配较小权重，分散较窄的核(如¹H)分配较大权重。在对八个蛋白质的评估中，该方法对亮氨酸和缬氨酸残基的分配准确率分别达到86%和95%，如果考虑第二佳RMSE匹配，这一数字可进一步提高至93%和96%。

研究结论表明，新型(2-¹³C,3-甲基-¹³C,4-¹³C,3-²H)α-酮异戊酸前体为获取缬氨酸(¹³C_α)和亮氨酸(¹³C_β)残基的额外化学位移信息提供了途径，显著简化了信号分配问题。结合D-葡萄糖-¹³C₆,1,2,3,4,5,6,6-²H₇标记，进一步提供了亮氨酸残基及其序列邻居的骨架化学位移信息。

虽然灵敏度限制可能阻碍侧链-骨架相关(通过HNCACB型实验)在超大分子系统中的应用，但新型SOFAST HMBC-CC-HMQC实验通过提供单个甲基基团的额外(¹³C_α/¹³C_β)化学位移信息，促进了偕二甲基基团的明确识别。该方法预计将在中等大小蛋白质(MW<45 kDa)的分配中找到广泛应用，SOFAST-HMBC-CC-HMQC甚至可能协助中等至大体系中的无骨架甲基共振分配，正如在Ignicoccus islandicus苹果酸 dehydrogenase(134 kDa)和 Homo sapiens Tom70(60.2 kDa)两个案例中所展示的那样。

这项研究的重要意义在于它为解决大蛋白质甲基归属这一长期难题提供了完整的技术方案。通过整合化学合成、脉冲序列设计和人工智能预测，建立了一个从化学前体制备到最终信号归属的完整工作流程。这不仅推动了核磁共振技术在结构生物学中的应用边界，也为研究大型蛋白质复合物和分子组装体提供了新的工具和方法，对药物设计和蛋白质功能研究具有重要价值。该论文发表在《Journal of Molecular Biology》，展示了多学科交叉融合在现代科学研究中的强大生命力。