手性依赖性重塑免疫抑制微环境，以实现气体/化学动力学增强的免疫疗法

《Journal of Colloid and Interface Science》：Chirality-dependent reshaping of immunosuppressive microenvironment for gas/chemodynamic enhanced immunotherapy

该研究设计了一种具有手性结构的D-铜碳 dots（Cu CDs）纳米系统，通过多酶样催化和NO生成效应重塑肿瘤免疫抑制微环境，协同ROS和NO增强免疫治疗，克服CD47介导的耐药性，显著抑制肿瘤生长。

　　

李书兰|段梦蝶|程国东|侯华英|徐楚|刘毅

摘要

复杂的肿瘤微环境（TME）会转变为一个支持肿瘤生长的环境，这种环境在保护肿瘤细胞的同时，也会对肿瘤治疗产生阻碍。本文设计了一种具有多种酶样活性和一氧化氮（NO）生成能力的手性纳米系统（L/D-Cu CDs），通过其与生物系统的手性依赖性相互作用，有效重塑肿瘤的免疫抑制微环境，并实现基于气体/化学动力学的增强型免疫疗法。D-Cu CDs相比L-Cu和DL-Cu CDs，对肿瘤细胞表面的CD47受体具有更强的结合亲和力，这有助于它们通过网格蛋白介导的内吞作用被肿瘤细胞内化。此外，D-Cu CDs还充当了稳态调节剂，生成活性物质O?和NO，破坏氧化还原平衡和铜离子的稳态，同时缓解TME的缺氧状态，从而促进肿瘤细胞的凋亡和铜死亡（cuproptosis），并有效诱导巨噬细胞从抗炎型的M2表型极化为促炎型的M1表型。体外和体内实验结果证实了D-Cu CDs的免疫刺激效果和肿瘤抑制能力，验证了它们重塑肿瘤免疫抑制微环境并实现气体/化学动力学增强型免疫疗法的能力。这项工作不仅阐明了手性Cu CDs介导的肿瘤免疫抑制微环境重塑机制，还为手性纳米材料在肿瘤治疗中的应用提供了新的视角。

引言

免疫疗法因其能够特异性地靶向并消除肿瘤细胞而在癌症治疗中引起了广泛关注[1,2]。然而，肿瘤细胞独特的代谢特性导致了免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的形成，显著降低了免疫疗法的效果。例如，TME中的缺氧、炎症、酸性等环境因素会直接损害细胞毒性T淋巴细胞并激活免疫抑制细胞，从而降低免疫效果[3,4]。此外，TME中存在的免疫相关炎症因子、细胞因子等成分还会促进恶性肿瘤的发生、发展和转移[5,6]。因此，逆转免疫抑制性的TME对于实现有效的癌症治疗至关重要。

气体疗法作为一种环保的治疗方式，通过引入具有特殊生理活性的气体来调节肿瘤进展[7]。一氧化氮（NO）作为一种内源性气体信号分子，在高浓度下可以抑制细胞呼吸和DNA修复，并促进细胞凋亡，因此被应用于肿瘤治疗[8,9]。NO还在调节血管生成和维持血管功能方面发挥着关键作用。研究发现，NO可以通过正常化肿瘤血管来缓解缺氧和酸性，从而逆转TME的免疫抑制[10],[11],[12]。然而，NO的半衰期较短，大大限制了其治疗效果。值得注意的是，活性氧（ROS）作为生理功能的关键调节因子，已被广泛用于通过破坏氧化还原平衡来抑制肿瘤生长[13,14]。最近的研究表明，纳米材料能够有效调节氧化还原平衡，为基于ROS的增强型疗法提供了有前景的平台[15,16]。重要的是，ROS可以与NO反应生成活性氮物种（RNS），后者具有毫秒级的半衰期，并具有更强的硝化作用和氧化还原平衡破坏能力[17,18]。此外，RNS还被报道能够将肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）从促肿瘤的M2表型极化为具有抗肿瘤作用的M1表型，从而逆转免疫抑制性微环境[19]。因此，结合使用ROS和NO有望克服免疫抑制，激活高效的抗肿瘤治疗。

值得注意的是，手性纳米材料与手性生物分子之间的立体选择性识别可以直接影响细胞粘附和细胞摄取等生理过程。因此，不同的手性纳米材料在生物活性和药理学上往往存在显著差异。本文开发了一种能够生成NO和ROS的手性纳米系统（L/D-Cu CDs），以逆转肿瘤的免疫抑制微环境并增强免疫疗法（图1）。制备的手性L/D-Cu CDs表现出多酶模拟活性，能够实现手性依赖性的ROS生成和NO释放，不仅诱导细胞凋亡和铜死亡，还能使TAMs极化为M1表型，从而逆转免疫抑制性TME。由于手性纳米系统对细胞膜表面特定蛋白受体CD47的较高亲和力，D-Cu CDs表现出更高效的细胞摄取和生物效应，从而触发更强的抗肿瘤免疫效果，实现气体/化学动力学增强型免疫疗法。这项工作为手性纳米材料在肿瘤治疗中的应用提供了新的视角，克服了肿瘤免疫抑制微环境对治疗的限制。

材料

DL/L/D-精氨酸（DL?/L/D-Arg，纯度98%）购自Macklin（中国上海）。氯化铜二水合物（CuCl?·2H?O，纯度99%）购自上海新华制药试剂有限公司。谷胱甘肽（GSH，纯度98%）、5,5-二甲基-1-吡咯烷N-氧化物（DMPO）、5,5'-二硫代（2-硝基苯甲酸）（DTNB，纯度99%）购自上海阿拉丁试剂有限公司。钙黄素乙酰氧甲基酯（Calcein-AM）、碘化丙啶（PI）、2,7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）等试剂也来自同一公司。

合成与表征

手性掺铜碳点（DL/L/D-Cu CDs）是通过后修饰方法合成的。首先，使用手性前体DL-、L-或D-精氨酸（Arg）通过常规水热法制备出手性碳点（CDs）[20]。随后，通过掺入铜离子制备出手性Cu CDs。透射电子显微镜（TEM）图像显示，DL-、L-和D-Cu CDs均为单分散球形颗粒，粒径约为2.8纳米。随着铜的掺入...

结论

综上所述，本研究合成了手性Cu CDs，以探究其基于手性的肿瘤免疫抑制微环境重塑能力和气体/化学动力学增强型免疫疗法的效果。与L-Cu和DL-Cu CDs相比，D-Cu CDs对肿瘤细胞表面的CD47受体和网格蛋白具有更强的结合亲和力，使得它们在肿瘤细胞中的富集程度更高。在内吞过程中，D-Cu CDs表现出类似过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性以及NO生成能力...

CRediT作者贡献声明

李书兰：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源获取、项目管理、方法学设计、资金申请、概念构思。段梦蝶：数据可视化、验证、软件使用、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构思。程国东：软件使用、方法学设计、实验实施。侯华英：软件使用、方法学设计、数据分析、概念构思。徐楚：软件使用、方法学设计、概念构思。刘毅：撰写 – 审稿与编辑、监督。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（22203061、U23A2089）、天津市科技计划（24JRRCRC00040）以及河北省自然科学基金（B2024110033）的支持。