利用双金属掺杂石墨烯量子点纳米酶的协同多模式疗法，用于根除耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）生物膜并促进感染伤口的愈合

《Journal of Colloid and Interface Science》：Synergistic multimodal therapy using bimetallic-doped graphene quantum dot nanozyme for the eradication of MRSA biofilms and enhancement of infected wound healing

Cu,Fe,S,N-GQDs@Ru-NO纳米酶系统通过整合化学动力疗法、光热疗法、光动力疗法和NO气体疗法，有效破坏MRSA生物膜并促进伤口愈合，在体内外实验中展现出协同治疗优势。

　　细菌生物膜相关感染，尤其是由甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的感染，对临床伤口管理构成了重大挑战。这些感染的特性包括对传统抗生素的固有耐药性，以及对组织修复和伤口愈合能力的严重影响。因此，开发新的治疗策略，以有效破坏生物膜并对抗耐药性细菌感染，成为当前研究的重点。

本研究提出了一种多功能双金属掺杂纳米酶系统，命名为Cu,Fe,S,N-GQDs@Ru-NO。该系统通过化学动力学治疗（CDT）、光热治疗（PTT）、光动力学治疗（PDT）和一氧化氮（NO）气体治疗的协同作用，实现了对生物膜的高效破坏。该纳米酶的合成采用了水热法，其中Cu和Fe共掺杂的石墨烯量子点（Cu,Fe,S,N-GQDs）通过酰胺键连接到一种能够释放NO的前药（Ru-NO），从而实现了精准的功能化。这种纳米酶结构赋予了其多种催化和治疗功能：双金属掺杂显著增强了活性氧（ROS）的催化生成，包括羟基自由基（•OH）和单线态氧（¹O?）；同时，该纳米酶在808 nm近红外（NIR）照射下表现出高效的光热转换能力，并能实现NO的可控释放。这些多模式作用协同作用，破坏细菌细胞膜，氧化NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），并消耗ATP，从而有效实现生物膜的分解，达到体外超过99%的细菌清除率以及完全的生物膜清除效果。

在MRSA感染伤口的小鼠模型中，使用该纳米酶的治疗显著加速了伤口闭合，表现为炎症反应减弱（IL-6水平降低）和血管生成增强（VEGF和α-SMA表达上调），同时没有检测到对正常组织的细胞毒性或系统性不良反应。该研究提出了一种多功能纳米酶平台，不仅能够有效清除多重耐药生物膜，还能积极促进组织再生，为下一代抗菌治疗药物的研发提供了新的思路和前景。

细菌生物膜的形成是一个复杂的过程，涉及细菌附着、生物膜形成以及感染建立等多个关键阶段。生物膜是细菌形成的一种动态微生态系统，由多种细胞外聚合基质构成。这些基质包裹着大量细菌，形成了一层保护性的结构，这种结构能够有效阻止药物的渗透，从而显著增加治疗难度。因此，迫切需要开发新的策略，以有效破坏生物膜并对抗耐药性细菌感染。

纳米酶是一种具有类似天然酶催化特性的纳米材料，其优势包括广谱抗菌活性、高催化效率、低诱导耐药性的风险以及易于合成，因此在抗菌领域引起了广泛关注。与传统抗生素不同，纳米酶能够通过多种机制作用于细菌，包括生成活性氧（ROS）和物理破坏、化学氧化等。这些机制能够有效破坏细菌结构，并显著降低耐药性的发生概率。然而，大多数现有的纳米酶主要由金属氧化物、金属纳米颗粒和贵金属合金组成，这些材料在实际应用中常常面临挑战，如生物安全性不足、成本较高以及容易引发免疫反应。

石墨烯量子点（GQDs）是一种零维纳米材料，其特征是具有共轭的sp²碳矩阵和外围的功能基团，表现出独特的量子限域效应和边缘介导的功能。由于其纳米级尺寸（<10 nm）、高比表面积、良好的生物相容性和卓越的化学稳定性，GQDs已成为下一代纳米酶开发的有前景候选材料。GQDs的催化能力来源于其原子级精确的纳米结构，其中量子尺寸、边缘构型和表面功能化等结构参数在调控电子转移动力学中起着关键作用。已有策略用于增强GQDs纳米酶的活性，包括表面工程（如羧基化、氨基化）、杂原子掺杂（如N、S、B）、形态调控以及外部能量场辅助（声波或光激活）。其中，金属掺杂通过掺杂剂诱导的电荷重分布和缺陷介导的催化活性位点的协同作用显示出巨大的潜力。尽管单金属掺杂（包括Fe、Cu、Mn或Co）已被广泛研究，但双金属掺杂系统仍需进一步探索。引入双金属中心为利用不同d轨道构型之间的协同作用提供了新的机会。这种方法可以导致电子结构的显著变化，可能包括：（1）增加活性位点的密度，（2）通过优化费米能级的对齐，促进不同金属之间的电子转移，（3）改善底物的吸附和脱附动力学。这些效应可以增强酶活性和抗菌效果，达到单金属系统无法实现的水平。

在本研究中，我们合成了双金属掺杂的Cu、Fe、S和N掺杂的GQDs纳米酶，并随后将其与能够释放NO的前药Ru-NO结合。因此，成功开发了一种多功能抗菌纳米酶Cu,Fe,S,N-GQDs@Ru-NO。该纳米酶具有负电荷表面，通过静电相互作用，能够特异性地靶向炎症和感染部位。这一特性显著降低了对正常组织的毒性。此外，该纳米酶能够通过与感染微环境中高浓度的H₂O₂相互作用，催化生成高度反应性的羟基自由基（•OH）。同时，在808 nm近红外光照射下，Cu,Fe,S,N-GQDs@Ru-NO能够释放NO气体，并高效生成活性氧（¹O?），并伴随热量的产生。这些协同效应能够破坏细菌细胞膜，诱导脂质过氧化、蛋白质失活，并触发DNA链断裂。此外，该纳米酶通过氧化NADH为NAD⁺，调节细胞代谢和能量供应，从而影响细菌内部的氧化还原平衡。释放的NO气体不仅直接参与抗菌过程，还能促进感染伤口的愈合。综上所述，Cu,Fe,S,N-GQDs@Ru-NO纳米酶在MRSA感染伤口的小鼠模型中表现出显著的治疗效果，通过CDT、PTT、PDT和基于NO的气体治疗的协同作用，为有效对抗MRSA感染提供了新的策略。

本研究的成果为开发高效抗菌药物提供了重要的参考价值。传统单一疗法（如仅使用CDT或PTT）在复杂的生物膜微环境中表现出明显的局限性，主要受到细菌抗氧化防御机制的限制。因此，开发一种能够整合多种治疗模式的纳米酶系统，不仅能够克服这些挑战，还能提高治疗效果。Cu,Fe,S,N-GQDs@Ru-NO纳米酶的合成方法为未来的抗菌纳米材料提供了可借鉴的路径，其结构设计和功能化策略可以应用于其他类型的耐药性细菌感染。此外，该纳米酶在体外和体内均表现出良好的生物相容性和低毒性，这使其在临床应用中具有较大的潜力。

在实验材料和仪器方面，本研究使用了多种高纯度试剂和溶剂，如RuCl₃·nH₂O、CuCl₂·2H₂O、FeCl₃·6H₂O、Na₂S等，均购自Aladdin试剂公司。其他实验材料如琼脂、肽胨、酵母提取物、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、胎牛血清（FCS）、检测试剂盒以及青霉素/链霉素等，均购自Beyotime生物技术公司。实验中使用的材料均符合试剂级纯度标准。此外，实验中涉及的细胞株，如人脐静脉内皮细胞（HUVEC）等，均从相关细胞库中获取，并按照标准操作流程进行培养和处理。

在合成和表征Cu,Fe,S,N-GQDs@Ru-NO纳米酶的过程中，首先按照图1a所示的流程制备了Cu,Fe,S,N-GQDs纳米材料。在制备过程中，对已有的方法进行了适当调整，以优化其结构和性能。随后，使用乙二胺对Cu,Fe,S,N-GQDs进行功能化处理，生成氨基功能化的Cu,Fe,S,N-GQDs-NH₂。接着，通过形成酰胺键，将Cu,Fe,S,N-GQDs-NH₂与[(tpy^COOH)Ru(bpy)(NO)](PF₆)₃结合，从而生成最终的纳米酶复合物Cu,Fe,S,N-GQDs@Ru-NO。该合成过程的关键在于通过精确的化学修饰，实现纳米酶的多功能化。合成后的纳米酶通过多种表征手段进行分析，包括扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、X射线光电子能谱（XPS）以及紫外-可见光谱（UV-Vis）等，以确认其结构和组成。此外，通过荧光光谱和热力学测试，进一步验证了其在光热治疗和NO释放方面的性能。

在实验结果分析中，Cu,Fe,S,N-GQDs@Ru-NO纳米酶在体外和体内均表现出优异的抗菌性能。在体外实验中，通过评估细菌的存活率、生物膜的破坏程度以及细胞的代谢变化，验证了该纳米酶的多功能治疗效果。实验结果显示，该纳米酶能够显著降低MRSA的存活率，并有效破坏其生物膜结构。在体内实验中，通过小鼠模型评估了该纳米酶对感染伤口的治疗效果。实验结果表明，该纳米酶能够显著加速伤口愈合，提高组织修复能力，并减少炎症反应。此外，通过组织病理学分析和免疫组化检测，进一步确认了该纳米酶在促进组织再生方面的潜力。这些实验结果不仅验证了该纳米酶的抗菌性能，还为其在临床应用中的可行性提供了支持。

在实验结论部分，本研究成功开发了一种新型双金属掺杂纳米酶系统，能够有效清除MRSA生物膜并显著促进感染伤口的愈合。该纳米酶通过CDT、PTT、PDT和基于NO的气体治疗的协同作用，实现了对细菌的多靶点攻击。与传统单一疗法相比，该纳米酶在复杂的生物膜微环境中表现出更高的治疗效率，主要归因于其多重作用机制的协同效应。此外，该纳米酶在体外和体内均表现出良好的生物相容性和低毒性，这使其在临床应用中具有较大的潜力。因此，该研究不仅为开发新型抗菌药物提供了新的思路，也为解决当前抗生素耐药性问题提供了可行的解决方案。

本研究的创新点在于设计和开发了一种多功能纳米酶系统，其不仅能够有效清除多重耐药生物膜，还能促进组织再生。这种多功能纳米酶系统的开发为抗菌治疗领域带来了新的突破。此外，该纳米酶的合成方法和功能化策略为未来的抗菌纳米材料提供了可借鉴的路径。通过精确的化学修饰，该纳米酶能够实现对多种治疗模式的整合，从而提高治疗效果。因此，该研究不仅在科学上具有重要意义，也在临床应用中具有广阔的前景。

在实验过程中，我们还进行了系统的分析和验证，以确保该纳米酶的性能和安全性。通过多种实验手段，如细胞毒性测试、炎症反应评估、血管生成分析以及组织病理学检测，全面验证了该纳米酶的治疗效果。实验结果表明，该纳米酶在体外和体内均表现出良好的生物相容性和低毒性，这使其在临床应用中具有较大的潜力。此外，该纳米酶的多功能性使其能够同时作用于细菌和宿主细胞，从而实现更全面的治疗效果。

综上所述，本研究开发的Cu,Fe,S,N-GQDs@Ru-NO纳米酶系统，为对抗MRSA感染提供了新的策略。该系统通过多种治疗模式的协同作用，显著提高了抗菌效果，并促进了组织再生。因此，该研究不仅在科学上具有重要意义，也为未来的抗菌治疗药物研发提供了重要的参考价值。