在选择用于分析3聚体磷硫酰化寡核苷酸的色谱柱时，其对亲水相互作用液相色谱分析结果的影响

《Journal of Chromatography A》：Impact of column selection for the analysis of 3mer phosphorothioated oligonucleotides in hydrophilic interaction liquid chromatography

短寡核苷酸HILIC分析中，阴离子型固定相有效抑制二聚体峰展宽并实现序列特异性分离，特别在3'端和5'端单碱基差异检测中表现优异。经比较二醇、酰胺及手性柱（环果糖、奎宁基）时，zwitterionic SPs（如Se-Quant ZIC-HILIC）在pH 4.5-7.0、缓冲液浓度0.1-0.5 M条件下，兼具高保留容量与最佳二聚体分离抑制效果。该研究为修饰寡核苷酸代谢物分析提供了方法学依据。

　　随着基因治疗和反义治疗领域的发展，寡核苷酸药物的应用日益广泛。这类药物在治疗中常被修饰以增强其稳定性与生物活性，其中一种常见的修饰方式是硫代磷酸酯（PS）修饰。PS修饰通过将磷酸酯中的一个或多个氧原子替换为硫原子，有效减少了寡核苷酸在体内被核酸酶降解的可能性，从而提高了其药效和半衰期。然而，这种修饰也会引入新的手性中心，使得寡核苷酸在色谱分析过程中表现出不同的对映异构体，从而影响其分离效果。因此，研究适用于短链寡核苷酸（如3mer）的色谱分析方法显得尤为重要。

本研究选取了3mer寡核苷酸作为分析对象，这些寡核苷酸代表了治疗性寡核苷酸如nusinersen（药物Spinraza）的常见代谢产物。nusinersen是一种用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的药物，其化学结构和修饰方式决定了其在体内的代谢途径。由于3mer寡核苷酸的长度较短，且具有特定的PS修饰位置，它们在色谱分析中表现出不同的行为，包括对映异构体的分离和序列差异带来的分辨率变化。研究的主要目标是评估羟基亲和液相色谱（HILIC）在短链寡核苷酸分析中的适用性，并探讨不同色谱条件（如流动相中水相的pH值、缓冲液浓度和柱温）对寡核苷酸分离的影响。

HILIC作为一种非离子对色谱方法，已被广泛应用于寡核苷酸的分析，因为它避免了流动相中离子对试剂对质谱系统（MS）的干扰。然而，HILIC在分离短链寡核苷酸时也面临一些挑战，例如较长的平衡时间、较低的重现性以及非特异性吸附效应。相比之下，离子对反相液相色谱（IPRPLC）虽然能提供更高的MS灵敏度，但其分离过程中常常伴随着对映异构体的分离，导致色谱峰的展宽，从而影响分辨率。因此，寻找一种既能有效分离短链寡核苷酸，又能减少对映异构体干扰的色谱方法，成为当前研究的重点。

本研究选取了多种色谱柱进行测试，包括几种典型的两性离子柱、二醇柱、酰胺柱以及两种手性柱（环糊精基和奎宁基）。通过对这些色谱柱在不同条件下的表现进行评估，研究团队希望找到适用于短链寡核苷酸分析的最佳方法。结果表明，两性离子色谱柱在分离短链寡核苷酸方面表现出较大的潜力，尤其是在抑制对映异构体分离和提高分辨率方面。二醇柱虽然能够部分分离对映异构体，但在所有测试条件下都表现出色谱峰的展宽，从而影响了寡核苷酸的分辨率。相比之下，手性柱在分离对映异构体方面表现较好，但其在处理短链寡核苷酸时的分辨率和重现性仍有待提高。

在实验过程中，研究团队使用了多种测试寡核苷酸，这些寡核苷酸的序列和PS修饰位置各不相同，从而能够全面评估不同色谱柱的分离能力。通过对这些寡核苷酸在不同色谱条件下的分离效果进行分析，研究发现色谱柱的类型和条件对寡核苷酸的保留和分辨率具有显著影响。例如，在某些条件下，两性离子柱能够提供较高的保留能力和较好的分辨率，而在其他条件下，酰胺柱则表现出更优的性能。此外，研究还发现流动相中水相的pH值和缓冲液浓度对寡核苷酸的分离效果具有重要影响，合适的pH值和缓冲液浓度可以有效提高分辨率并减少色谱峰的展宽。

实验结果还表明，HILIC在分离短链寡核苷酸时具有较高的峰容量，尤其是在使用Se-Quant ZIC-HILIC和Atlantis Premier BEH Z-HILIC柱时，能够在较宽的色谱条件下提供良好的分离效果。这些色谱柱在抑制对映异构体分离和提高分辨率方面表现出色，从而为短链寡核苷酸的分析提供了新的思路。然而，研究也指出HILIC在处理短链寡核苷酸时仍然存在一些局限性，例如平衡时间较长、重现性较低以及非特异性吸附效应较明显。因此，进一步优化HILIC的色谱条件和色谱柱的选择，将有助于提高短链寡核苷酸的分离效果。

综上所述，本研究为短链寡核苷酸的色谱分析提供了重要的参考，特别是在HILIC的应用方面。研究结果表明，两性离子柱在抑制对映异构体分离和提高分辨率方面具有显著优势，而其他类型的色谱柱则在特定条件下表现出不同的性能。未来的研究可以进一步探讨不同色谱柱和条件对短链寡核苷酸分离的影响，以期找到更加高效和可靠的分析方法。此外，研究团队还希望在未来的工作中，能够开发出更加适用于短链寡核苷酸分析的色谱技术，从而为治疗性寡核苷酸的开发和应用提供更加坚实的分析基础。